刘琳琪，黎成勇，黄永平

（长沙学院 生物工程与环境科学系，湖南 长沙410003）

分析测试

高效液相色谱法测定乳粉中苯甲酸含量的不确定度评定

刘琳琪，黎成勇，黄永平

（长沙学院 生物工程与环境科学系，湖南 长沙410003）

依据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》的原理与方法，建立了液相色谱法测定乳粉中苯甲酸含量的测量不确定度评定的数学模型，并对测试过程中不确定度分量的来源进行了分析、量化和合成。结果表明：最终结果的不确定度主要由样品处理过程产生的不确定度引起。

液相色谱；乳粉；苯甲酸；不确定度评定

Abstract:Based on JJF1059-1999 Evaluation of the Uncertainty of Determination and Expression,a mathematicalmodel was established to assess the uncertainty of analyzing benzoic acid in milk powder by HPLC.Factors thatwere contributing to the uncertainty were analyzed,quantified and synthesized.The results showed that the uncertainty of this experiment ismainly caused by the treatmentof sample.

Key words:liquid chromatography；milk powder；benzoic acid；uncertainty evaluation

苯甲酸是一种广泛使用的食品防腐剂，依据GB2760-2007规定，可应用于果脯、蜜饯、调味料、腌制蔬菜、果汁饮料、果酒等食品中，不允许在乳制品中添加[1]。但是，乳中本身含有苯甲酸。根据消费者对乳制品中苯甲酸的关注，以及对乳制品安全风险评价的需要，新的乳制品标准正在修订中，根据专家的建议，已将苯甲酸含量列为产品质量指标之一，并规定了允许检出的最高限量值。为了在测量结果的表达和质量评定等方面更为准确，本实验参照GB/T21703-2008《乳与乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定》中检测方法[2]，根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》对乳粉中苯甲酸含量的不确定度进行了测量和评定[3]，以期为评定测量结果质量提供理论基础和科学依据。

1 测量方法

1.1 仪器与试剂

1200高效液相色谱仪（安捷伦公司）。

苯甲酸标准品（sigma公司）；甲醇（色谱纯），水（超纯水）；其他试剂均为分析纯。

1.2 试样处理

准确称取3g样品，加10mL水溶解，再加入0.1mol·L-1NaOH溶液25mL于超声波水浴中处理15min。用 0.5mol·L-1H2SO4pH 值到 8，加入 92g·L-1的亚铁氰化钾和183g·L-1的乙酸锌溶液各2mL，剧烈振摇后定容到100mL，静置15min，上清液过滤膜用于高效液相色谱分析。

1.3 色谱条件

色谱柱为AgilentXDBC18色谱柱（4.6250mm）；流动相为甲醇：磷酸盐缓冲溶液（pH值为6.7）=1∶9；流速 1.2mL·min-1；检测波长 227nm；柱温为室温；进样量10μL。

2 数学模型

式中 X：样品中苯甲酸的含量，mg·kg-1；As：样品溶液中苯甲酸的响应值（峰面积）；Ar：标准溶液的响应定量检测公式：值（峰面积）；C：标准溶液的浓度，μg·mL-1；V：样品溶液定容体积，mL；m 为样品质量，g；frec：回收率校正因子，为回收率的倒数。

从检测过程和数学模型分析，本实验的测量不确定度主要来源于标准溶液浓度、样品溶液的响应值、标准溶液的响应值、样品称量、定容体积、回收率等几个方面[4]。

3 不确定度分量的来源及其量化

3.1 试样称量的不确定度Urel(m)

3.1.1天平的不确定度Urel（m1）天平校准证书给出的在95%置信水平时，Up＝0.3mg，按照正态分布考虑评定其标准不确定度U（m1）。查表得，当置信水平p＝95%时，kp＝1.96。

3.1.2 天平重复称样引起的不确定度 用砝码在该天平上9次重复测定，极差为R＝0.1mg，用极差法计算 U（m2），查表得 C＝2.97。

3.1.3 试样称量的相对不确定度合成

上述两项合成得出称量的不确定度为：

本实验中称样量为3g，相对不确定度Urel（m）=U（m）/m=0.1535/3000=5.1210-5

3.2标准溶液的不确定度Urel（c）

3.2.1标准物质引入的不确定度Urel（std）

标准物质购自sigma公司，根据标准物质证书不确定度为1%，k=2，其相对不确定度为：Urel（std）=1%/2=0.005。

3.3 试样处理定容体积的不确定度Urel（V）

3.4 样品溶液响应值的不确定度Urel（As）

标准溶液响应值的不确定度包括色谱仪的测量线性和色谱测量重复性。

（1）因为测量时结果均在色谱仪的测量线性范围内，所以色谱仪的测量线性产生的不确定度可忽略。

（2）色谱测量重复性包括进样系统引入的不确定度、检测器引入的不确定度和仪器数据处理系统引入的不确定度。色谱测量重复性可用重复进样来评定，该不确定度属于A类评定。将处理好的样品溶液连续进样9次，所得测量峰面积为：114.3、113.3、114.0、114.6、113.8、113.6、115.1、113.8、114.9。以平均值的实验标准差s（x¯）作为测量结果的标准不确定度。标准不确定度和相对标准不确定度分别为：

3.5标准溶液响应值的不确定度Urel（Ar）

按照3.4同法分析，将标准工作液连续进样9次，所得测量峰面积为：99.3、101.2、100.4、99.8、99.5、100.1、101.7、100.5、101.4。标准不确定度和相对标准不确定度分别为：

3.6回收率因子的不确定度Urel（frec）

回收率是在样品处理过程中产生的，主要由样品均一性、溶液转移、提取效率、制备过程复杂程度等因素引入。本实验采用添加苯甲酸标准物质高、中、低3个水平，每个水平平行测定3次，9次添加回收率的相关数据进行计算，其回收率结果见表1。按照标准不确定度的A类评定，以平均值的实验标准差作为s（x¯）测量结果的标准不确定度。标准不确定度和相对标准不确定度分别为：

表1 回收率测定结果Tab.1 Determination results for recovery

同时，对平均回收率进行显著性检验（t检验），当检验值 t大于或等于 t（0.05/2，8）=2.306 时，说明有显著性差异，计算公式中需采用frec以修正结果；当检验值 t小于 t（0.05/2，8）时，说明无显著性差异，计算公式中不必采用frec以修正结果。计算结果如下：

t值大于临界值t(0.05/2，8)=2.306，说明有显著性差异，计算公式中需采用frec以修正结果。

4 不确定度的合成和扩展

4.1 合成相对不确定度根据2中给出的数学模型，将以上各相对不确定度分量合成：

4.2 扩展不确定度

合成不确定度U（X）=Urel（X）×X=0.0154×31.4=0.48mg·kg-1，其中 31.4mg·kg-1为本实验测得实际乳粉样品的苯甲酸含量平均值。取包含因子k＝2，则扩展不确定度为：

5 测量不确定度报告

按照GB/T 21703-2008《乳与乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定》测定乳粉中苯甲酸含量结果为：X=31.4±0.96mg·kg-1。

6 结论

综上所述，最终结果的不确定度主要由样品处理过程产生的不确定度引起，其他分量引起的不确定度与样品处理过程产生的不确定度相比较小，可忽略不计。在实验中，可以通过规范样品处理过程中的操作和提高提取效率，进一步提高回收率和减小测量结果的不确定度。

［1］GB 2760-2007食品添加剂使用卫生标准［S］.

［2］GB/T 21703-2008乳与乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定［S］.

［3］JJF 1059-1999测量不确定度评定与表示［S］.

［4］JJF 1135-2005化学分析测量不确定度评定［S］.

［5］JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程［S］.

Uncertainty evaluation for the determ ination of benzoic acid in m ilk powder by HPLC

LIU Lin-qi，LI C heng-yong，HUANG Y ong-ping（College of Bioengineering and Environmental Engineering,Changsha University,Changsha 410003，China）

O657.37

A

1002-1124（2011）01-0024-03

2010-10-22

刘琳琪（1982-），女，硕士，助教，从事化学分析教学工作。