刘章锁，王建军

1)河南省煤炭总医院胸外科郑州450011 2)华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科武汉430022

(2010-09-15收稿 责任编辑 姜春霞)

食管癌是发病率较高的一种恶性肿瘤，病理分型中鳞状细胞癌占95%，其生物学行为特点是侵袭性高，常发生局部浸润、累及临近淋巴结、淋巴播散及由血源性播散引起广泛转移，术后5 a生存率仅20% ～36%［1］。肿瘤细胞侵袭黏附是肿瘤重要的生物学行为之一，是恶性肿瘤浸润转移的关键一步。反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)技术能够干预肿瘤的生物学行为，逐渐成为肿瘤基础和临床研究的热点。该实验通过应用ASODN技术，研究血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like protein 3，ANGPTL3)对食管癌细胞EC9706侵袭黏附能力的影响，探讨ANGPTL3 ASODN对食管癌浸润转移生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 EC9706细胞购自中国科学院上海生物细胞研究所。ASODN由北京赛百盛生物技术有限公司合成。其他试剂均为进口超纯级或国产分析纯以上级产品。主要实验仪器为:日本O-lympus CK40型倒置显微镜，美国Applied Biosystems PCR扩增仪，大连Jim-X Scientific凝胶图像分析系统，美国Costar细胞培养板和Transwell小室，南京华东电子集团公司产酶联免疫检测仪。

1.2 EC9706细胞培养 将EC9706细胞冻存管迅速投入37℃恒温水浴箱中解冻，无菌操作将冻存管内的EC9706细胞移入离心管，离心(1 000 r/min)约10 min，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮沉淀的细胞，转移到培养瓶中，置37℃ CO2培养箱中培养。观察细胞状态，当细胞覆盖率达80% ～90%时，吸尽细胞培养瓶内旧培养液，用PBS液冲洗细胞2遍，加入2.5 g/L胰蛋白酶1 mL，倒置显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大时，加入体积分数10%RPMI 1640培养基终止消化，弃去消化液，向瓶底加入2 mL PBS液制成细胞悬液，置37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。

1.3 ASODN及RT-PCR引物的设计与合成 根据GenBank收录的ANGPTL3 mRNA序列，设计针对翻译起始部位的ASODN，作用在ANGPTL3的翻译起始密码子(AUG)后的18个碱基序列，其序列为5’-AAGGAGCTTAATTGTGAA-3’，经微机检索与ANGPTL3基因以外的人类基因无同源性。同时合成随机错义寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide，SCODN)，其 序 列 为 5’-TACGGATCCAATG CGACG-3’，经过微机检索与人类基因无同源性。由北京赛百盛生物公司合成，均进行硫代磷酸化修饰，即寡核苷酸磷酸二酯键内非连接氧被硫取代。部分寡核苷酸采用5’FAM荧光素标记。引物经PAGE纯化，冻干分装，－20℃保存。

1.4 脂质体-寡核苷酸混合液的制备 先用无血清不含抗生素的RPMI 1640培养基把ASODN配成20 μmol/L贮存液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌贮存。Lipofectamine 2000 4℃保存，转染基因前以试验需要的浓度将两者在室温下混匀30 min，形成脂质体-寡核苷酸混合液，其中寡核苷酸(μg)-脂质体(μg)=1-2。

1.5 体外细胞黏附实验 取对数生长期的细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104mL－1，接种200μL于96孔板，培养24 h。将实验分为对照组、ASODN组和SCODN组，分别在转染后30、60、90和120 min于酶联免疫检测仪570 nm波长处测定各孔吸光度值，计算细胞黏附率。黏附率=实验组吸光度值/对照组吸光度值。实验重复5次。

1.6 体外细胞侵袭实验 细胞分为3组，同1.5。将转染及未转染的细胞消化，吸取400μL细胞悬液加入到Transwell小室的上室，置于体积分数5%CO2培养箱中37℃条件下培养48 h，常规HE染色，随机选取5个400倍视野，计数穿膜细胞数，计算细胞侵袭抑制率。细胞侵袭抑制率=(对照组每视野下侵袭细胞数－ASODN组每视野下侵袭细胞数)/对照组每视野下侵袭细胞数×100%。实验重复5次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 10.0进行分析，3组间EC9706细胞黏附率和侵袭细胞数目的比较采用单因素方差分析和 SNK-q检验，SCODN组和ASODN组间侵袭抑制率的比较采用两独立样本的t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 转染后细胞形态 显微镜下可见EC9706细胞贴壁生长，多呈多角形，排列紧密。细胞核异形性明显，核仁清楚，胞质丰富(图1)。ASODN转染EC9706细胞48 h后，细胞的分布较未转染的对照组明显稀疏，细胞体积变小，皱缩呈圆形，胞核及胞质轮廓折射增强，较粗糙;部分细胞不再贴壁生长，悬浮于培养液中(图2)。

2.2 不同组别EC9706细胞黏附率比较 结果见表1。

表1 不同组别EC9706细胞黏附率

2.3 不同组别EC9706细胞侵袭能力比较 结果见图 2、表 2。

表2 不同组别EC9706细胞侵袭能力

3 讨论

肿瘤细胞侵袭黏附是肿瘤重要的生物学行为之一。恶性肿瘤细胞侵袭黏附能力决定着肿瘤新生血管形成和肿瘤浸润转移能力，进而影响恶性肿瘤临床治疗效果。ANGPTL3是一种分泌性蛋白因子［2］，结合于整合素αvβ3受体后，诱导内皮细胞的黏附和迁移，具有刺激鼠角膜血管生成的作用［3］。整合素可与基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)结合并正向调控MMPs的表达，从而直接破坏和降解ECM，为瘤细胞的浸润转移做了充分的准备［4］。

ASODN技术是根据核酸杂交原理，设计以序列特异性方式与DNA或RNA分子中的互补碱基序列结合，通过直接干扰或抑制RNA编码蛋白的产生而阻断基因的表达，以达到控制和治疗肿瘤的作用。研究［5］发现，肝素酶ASODN可有效降低肝素酶蛋白及mRNA的表达，从而抑制食管癌细胞的生长和转移。该实验应用ANGPTL3 ASODN转染EC9706细胞，观察对EC9706细胞黏附和侵袭能力的影响。结果显示，ASODN能明显降低EC9706细胞的黏附能力，同时EC9706细胞侵袭穿膜细胞数明显下降，侵袭抑制率显著升高。提示ANGPTL3 ASODN可能通过降低EC9706细胞中侵袭黏附相关基因，从而减弱食管癌肿瘤细胞的侵袭黏附生物学行为。

［1］ Bando E，Yonemura Y，Endou Y，et al.Immunohistochemical study of MT-MMP tissue status in gastric carcinoma and correlation with survival analyzed by univariate and multivariate analysis［J］.Oncol Rep，1998，5(6):1483

［2］ Conklin D，Gilbertson D，Taff DW，et al.Identification of a mammalian angiopoietin-related protein expressed specifically in liver［J］.Genomics，1999，62(3):477

［3］ Camenisch G，Pisabarro MT，Sherman D，et al.ANGPTL3 stimulates endothelial cell adhesion and migration via integrin alpha beta3 and induces blood vessel formation in vivo［J］.JBiol Chem，2002，277(19):17281

［4］ Fishman DA，Liu Y，Ellerbroek SM，et al.Lysophosphatidic acid promotes matrix metalloproteinase(MMP)activation and MMP-depend invasion in ovarian cancer cells［J］.Cancer Res，2001，61(7):3194

［5］陈奎生，张岚，唐琳，等.肝素酶反义寡核苷酸转染的人食管癌EC9706细胞中肝素酶 mRNA的表达［J］.郑州大学学报:医学版，2004，39(2):181