赵先胜，任志群

(1.浙江省宁波市传染病医院，浙江 宁波 315010; 2.西安交通大学医学院第一附属医院肝病科，陕西 西安 710061)

肿瘤的侵袭生长是一个多因素、多步骤的过程，细胞外基质(主要是Ⅳ型胶原蛋白)不仅是肿瘤细胞赖以生存的场所，还是肿瘤细胞迁徙的天然屏障。CD147又被称为促细胞外基质金属蛋白酶因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)或basigin，在肿瘤细胞表面高度表达，刺激肿瘤细胞周围的成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)。研究发现，CD147在多种肿瘤中高表达，同时MMP活性增加，与肿瘤的浸润和转移密切相关。笔者通过下调CD147基因表达来观察肝癌细胞增殖及凋亡的改变，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

含有人 U6启动子的 pSilencerTM4.1－CMV neo质粒(美国Ambion公司);大肠杆菌DH5α(大连宝生物工程有限公司);限制性内切酶(Bam HⅠ，HindⅢ)、T4 DNA连接酶(美国 NEB公司);DNA marker(大连宝生物工程有限公司);质粒小量抽提试剂盒(天为时代公司);胶回收试剂盒(广州美津生物公司);Lipofectamine 2000转染试剂盒、G418(美国 Invitrogen公司);内参 β－actin、CD147单克隆抗体(美国R＆D公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的制备

根据美国基因序列数据库中报道的CD147基因核苷酸序列(NM_198589)，输入Ambion公司的在线siRNA设计软件，软件将自动分析和显示候选siRNA。根据文献[3－4]报道的siRNA设计原则和经验，进一步在候选siRNA中筛选最佳者。设计的siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，引物序列见正义链:5'－AGCTTAAGACCTTGGCTCCAAGATACTCTCTTGAAGTATCTTGGAGCCAAGGTCG－3';反义链:5'－GATCCGACCTTGGCTCCAAGATACTCAAGAGAGTATCTTGGAGCCAAGGTCTTA － 3'。

1.2.2 CD147/siRNA表达载体的构建及鉴定

参照Ambion公司说明书，将合成的siRNA连接至pSilencerTM4.1－CMV neo质粒，转化至DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，用质粒小量抽提试剂盒小量提取质粒后，载体CD147/siRNA经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，样本送检行DNA测序。……