郭晓理，朱隽雅，施 辉*，王德琴，徐美玉

(1南通大学附属医院，江苏 南通 226001;2海安县人民医院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)常见并发症，其主要的病理改变是肾小球系膜细胞(GMCs)增殖及异常增多，细胞外基质(ECM)过度沉积。转化生长因子β1(TGF-β1)是其病理改变的主要介导物，不仅可上调ECM蛋白表达，还可降低ECM蛋白降解酶的活性。ECM的主要成分是FN，FN增多是ECM过度沉积的标志。2009年9月～2010年3月，本研究观察了高糖刺激对大鼠GMCs增殖的影响，并进一步观察了螺内酯干预后对大鼠GMCs增殖及TGF-β1、FN分泌的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠GMCs购自上海长征医院肾内科。低糖、高糖DMEM培养液，青—链霉素组合双抗为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。0.25%胰蛋白酶，24孔、96孔培养板为碧云天公司产品。螺内酯、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。噻唑蓝(MTT)为Amresco产品，ELISA试剂盒由博士德提供。Thermo MK3酶标仪为美国赛默飞世尔科技公司生产。

1.2 方法

1.2.1 大鼠GMCs培养 大鼠 GMCs常规培养在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中，置37℃5%CO2孵箱中培养。2～3 d传代1次。取对数生长期GMCs用于实验。分组:①低糖(5.5 mmol/L)对照组(LG组);②高糖(25 mmol/L)对照组(HG组);③SPI1 组(HG+0.25 μmol/L 螺内酯);④SPI2组(HG+2.5 μmol/L 螺内酯);⑤SPI3 组(HG+25 μmol/L螺内酯);⑥SPI4 组(HG+50 μmol/L 螺内酯)。每组设6个复孔。

1.2.2 螺内酯对大鼠 GMCs增殖的影响 采用MTT法。调整细胞密度至1×105个/ml，将GMCs接种于96 孔板，每孔 200 μl。分别培养 12、24、48 h，于培养结束前4 h加入20 μl的MTT溶液，37℃继续孵育4 h弃上清，加入150 μl的DMSO振荡。用酶标仪(波长490 nm)测定OD值。

1.2.3 TGF-β1、FN 的检测 采用 ELISA 法。调整细胞密度至2×105个/ml，将 GMCs接种于24孔板，每孔1000 μl。培养24 h后，检测不同浓度螺内酯作用后 TGF-β1、FN 的含量。并检测 25 μmol/L螺内酯作用12、24、48 h 时 TGF-β1、FN 的含量。操作过程严格按ELISA试剂盒操作说明进行。……