张雪梅，陈海龙，王朝晖，张 利，纪 军

肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡ cells，ATⅡ）对维持肺泡的结构和功能具有重要意义，其功能包括增殖、合成和分泌肺表面活性物质、维持肺泡内外液体平衡及免疫调节作用。研究表明，急性肺损伤（acute lung injury，ALI）时肺组织的病理变化表现为肺泡上皮细胞的严重损伤。ATⅡ在肺损伤后肺泡上皮的修复与更新、表面活性物质的分泌、肺水转运过程中均有重要意义[1-2]。但由于ATⅡ具有特殊的生物学特性，尚未形成细胞株供研究用，且其分离、纯化、鉴定及原代培养的操作较为繁琐，细胞形态功能易发生变化，给研究工作带来不便。本实验是在总结和借鉴国内外学者经验的基础上，改良大鼠ATⅡ的分离、培养及鉴定方法。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠20只（大连医科大学动物实验中心，许可证号SCXK（辽）2002-0002），体质量180～220 g。

1.2 主要实验仪器 细胞培养箱（Heraeus德国）；研究级荧光倒置生物显微镜（Leica美国）；低温离心机（Sigma美国）。

1.3 主要实验试剂 达尔伯克必需基本培养基（DMEM，GIBCO公司）；胎牛血清（FBS GIBCO公司）；大鼠IgG（Sigma公司）；脱氧核糖核酸酶（DN-ase，Sigma公司）；胰蛋白酶（Difico公司）；SP-A多克隆抗体(Santa Cruz公司)；SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要溶液 10%水合氯醛溶液。溶液Ⅰ：140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，6 mmol/L葡萄糖，0.2 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L磷酸氢钠缓冲液。溶液Ⅱ：溶液Ⅰ，2.0 mmol/L CaCl2，1.3 mmol/L MgS04[3]。用1 M NaOH调pH至7.4。溶液Ⅲ：溶液Ⅱ，0.25%胰蛋白酶，0.1%胶原酶。D-Hank液；0.25%胰蛋白酶，0.25%DNaseⅠ溶液。

2 方法

2.1 肺组织的消化及细胞混悬液的制备 大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg，肝素400 U/kg。消毒，气管插管，腹主动脉放血活杀，剪开胸腔，去除胸腺。注射器吸取溶液Ⅱ（预温至37℃），于右心耳的位置轻轻进入朝肺动脉的方向注入，灌洗至全肺呈苍白色以去除血细胞，灌注量20 mL；……