陈道桢,许 飞,葛海燕,徐兰兰,潘淑静,朱 斌*

(1.南京医科大学附属无锡妇幼保健院中心实验室,江苏无锡214002;

2.苏州大学基础医学与生物科学学院医学遗传研究室,江苏苏州 215123）

弓形虫病(Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,TOX）引起的人兽共患寄生虫病,孕妇感染弓形虫常致胎儿畸形、流产、死胎。目前普遍采用ELISA检测弓形虫感染,但敏感性较低且特异性不足;以PCR为基础的分子生物学技术检测虽然快速、灵敏,但普通PCR假阳性太高。LAMP是Notomi等[1]发明的一种新型核酸扩增技术,具有灵敏度高,特异性强,操作简单等优点,本研究在建立并优化LAMP定性检测弓形虫的基础上,首次建立了应用SYBR Green I定量检测及不需电泳的直接观察方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源刚地弓形虫RH株(国际强毒代表株）由南京医科大学寄生虫教研室王勇教授提供;57例孕妇外周血标本由苏州市立医院和无锡妇幼保健院提供,抽取静脉血,EDTA抗凝,-20℃保存。

1.2 主要试剂20×SYBRGreen I购自上海捷瑞公司,限制性内切酶SacI购自TaKaRa公司,Betaine和MgSO4购自Sigma公司,Bst DNA聚合酶购自New England Biolabs公司。

1.3 引物设计根据GenBank中弓形虫B1基因序列(Accession No:AF179871）,利用在线设计软件(http://primerexplorer.jp/e/）设计 LAMP引物,同时设计用于克隆用PCR引物,LAMP扩增区包含于克隆片段中,引物由上海博彩生物公司合成。见表1。

1.4 基因组制备及弓形虫B1基因重组质粒的构建抽取腹腔注射弓形虫速殖子感染3天的小鼠腹腔液200μ l,PBS洗涤,沉淀加入细胞裂解液 ,混合后55℃水浴过夜,经典苯酚氯仿法抽提总DNA。PCR扩增弓形虫B1基因片段大小为351bp,回收PCR产物后与pBS-T载体进行A-T连接、转化,筛选出阳性重组质粒,送上海生物工程有限公司测序鉴定,测得OD260值,计算拷贝数。……