于晓丽,焦立新

(长春市中心血站,吉林 长春 130033）

Rh血型是目前被国际输血协会(ISBT）认定的29个红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统,它是继ABO血型发现后临床意义最大的一个血型。主要抗原有D、C、c、E、e,其中D 抗原具有高度免疫原性,最具临床意义[1]。

1 资料与方法

1.1 对象长春地区随机抽取Rh阴性献血者血样60名。

1.2 间接抗人球试验确认RhD(-）血液

将60名阴性献血者的血样编号1-60,将其洗涤三次后配成5%红细胞悬液,各取1滴加入试管中,再向试管中加入2滴IgG的抗D试剂(上海血液生物医药有限公司）,37℃孵育30分钟。孵育30分钟后用生理盐水反复洗涤3次。弃尽上清,再向试管中加入广谱抗人球蛋白试剂(上海血液生物医药有限公司）,1000转1分钟离心,观察结果,有凝集者为RhD(+）,无凝集者为RhD(-）[2]。

1.3 基因组DNA提取

使用invitrogen DNA Isolation Kit(invitrogen Corporation,Wisconisin,USA）Lot:038 Batch:46481,按照说明书流程操作,从全血中提取基因组DNA。

1.4 序列特异性引物PCR(sequence-specific primer polymerase chain reaction,PCR-SSP）-琼脂糖凝胶电泳

1.4.1 2.5%琼脂糖凝胶的准备 将2.5 g琼脂糖加入100 ml×TBE溶液(Tis-硼酸盐-EDTA溶液）,加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入5 μ l EB,混合均匀。将混合好的凝胶溶液倒入凝胶槽内,插入电泳梳,待冷却后拔出电泳梳备用。

1.4.2 序列特异性引物PCR 筛选RHD(-）血液标本基因型采用天津秀鹏生物科技有限公司生产的特异性引物(引物包被在引物板上）,特异性检测RHD基因的第1、5、6、7外显子和845A/G 和1227A/G等位基因。一份样本检测4个外显子和4个等位基因。PCR反应体系总体积为50 μ l。含5 U Taq聚合酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）,200 μ mol/L dNTPs,模板 DNA 10 μ l(80-100 ng/μ l）。 在BIO-RAD iCycler DNA扩增仪96℃预变性2 min,随后96℃变性20 s,64℃退火50 s,72℃延伸45 s共32个循环。……