顾冬梅，刘 蔚

（1.苏州大学附属第一医院病理科；2.苏州大学医学部，江苏苏州 215123）

影响免疫组织化学染色质量的因素分析

顾冬梅1,2，刘 蔚1

（1.苏州大学附属第一医院病理科；2.苏州大学医学部，江苏苏州 215123）

免疫组化技术操作过程中存在很多影响因素，直接影响到免疫组化染色质量。要获得满意的免疫组化染色结果，必须采取可行有效的办法，从而为病理诊断提供可靠依据。

免疫组织化学；染色质量；影响因素

免疫组织化学是利用抗原抗体特异性结合这一原理，从组织细胞水平进行抗原抗体反应，对某些蛋白在组织切片或细胞标本中进行原位的定位、定性或定量研究的一种技术[1]。免疫组织化学技术是现代生物学领域中一项不可或缺的研究手段，尤其在临床病理诊断中发挥着极其重要的作用，为病理诊断提供有价值的线索。近年来，随着免疫组化技术的发展和各种特异性抗体的出现，许多疑难肿瘤得到了明确诊断，从而进一步提高了病理诊断的准确性，为疾病的治疗和预后的估计提供了重要的依据。分子医学的发展，将治疗性的人源性单克隆抗体引入了临床，免疫组织化学技术已经作为一项独立的检测指标用于指导临床的个性化治疗[2]。良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。但是，由于免疫组化技术操作的影响因素众多，常常导致免疫组化染色质量不稳定，影响最终诊断。如何避免和消除这些因素的影响，是我们每一位病理学工作者都希望解决的问题。对此，我们总结以往操作经验，归纳分析影响免疫组化染色质量的各种因素，旨在提高染色质量，获得满意的免疫组化染色结果。

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1 组织处理的影响因素

1.1 组织的取材、脱水及浸蜡 恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，不仅要求有效防止组织成分的自溶，保持组织结构和细胞形态的完整性，更需要保持细胞组织成分的抗原不受弥散或损坏。组织的处理包括组织的及时取材、固定和适宜的石蜡包埋处理。

——宁夏的一名高考落榜生被哈佛大学录取，并给予全额奖学金。这位姓杨的学生花了很多精力建立一个非政府公益组织，支援西部教育。哈佛方面对此作出如是解释。

取材是组织处理的第一步，免疫组化的取材特别强调及时，同时要注意：工具要锐利，切忌反复切拉组织造成局部组织的挤压、坏死；组织块大小要适中，理想的取材大小为0.2cm× 1cm×1cm，这样既能使固定剂快速有效地渗透到组织内部，使其充分地固定，也有利于脱水和浸蜡，又能防止组织的脱片。组织在脱水机中的处理条件应十分妥当，大量的实践经验表明，在加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚和脱水浸蜡处理不当所致。免疫组化要求组织脱水透明要够而不过，浸蜡的温度不宜超过58℃，时间过长会造成组织收缩和透明过度，其结果是组织切片困难，染色过程也极易脱片，且染色效果不好，如果HE切片尚做不出满意的染色结果，那么根本无法保证免疫组化的染色质量。

近年来，泥石流灾害研究已经成为了全球关注的热点问题，由于世界各国的自然地理条件和经济发展情况的差异，呈现出不同的研究方法与技术手段，并且在研究对象的选择上也大不相同，但是随着互联网的普及，各地区泥石流领域的研究与交流日益加深，泥石流研究的基本方法和观念等趋于统一。就我国而言，针对泥石流的相关研究起步相对较晚，以致于对泥石流的理论研究和实际观测趋于同步展开。

2.1 抗原修复及染色操作 在免疫组化染色中，抗原修复是影响染色结果极其重要的因素。所谓抗原修复，即破坏组织固定时分子间所形成的交联，而恢复抗原的原有空间形态。大量实践证明，加热抗原修复处理后的免疫组化染色敏感度大幅度地提高，因此得到了广泛的使用，为大多数抗体染色修复时所选用。而热修复中强力推荐使用高温高压抗原修复方法，实验结果显示，高压法的实验重现性与染色强度均优于其他热修复法（水浴法及微波法）。加热抗原修复缓冲液有多种，目前首选为0.01%柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体[4]。但部分难于表达的抗体应选择EDTA和Tris抗原修复效果较强的缓冲修复液为宜。

1.2 组织的固定 组织固定要及时充分。在众多的组织固定液中，如甲醛、乙醇、戊二醛、B5等等这些不同种类固定液在不同实验方法（如PCR、电镜、免疫组化、分子杂交等）的使用中各有千秋。但在保持组织和细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林都是首选。而在免疫组化染色中，固定剂首推的是10%中性福尔马林，福尔马林固定引起的组织抗原决定簇的交联与封闭可以通过抗原修复方法来修正[3]。为确保离体组织的抗原性，必须在手术后的15min内马上固定，组织须浸没于固定液中，对于绝大部分组织，在常温条件下固定8-24h最佳。

通常免疫组化染色采用的是辣根过氧化物酶系统，其检测方法简便易行，试剂稳定。因此显色剂首选的是DAB，其配制方法简单，在组织切片上定位比较清晰，染色结果非常容易保存。DAB显色时间以及DAB显色剂的浓度对免疫组化的染色结果有很大影响，浓度过高、时间过长均会造成染色结果太深而影响观测甚至造成假阳性，因此DAB应遵循说明书浓度现配现用，时间控制以在镜下为佳，显色以在2-10min内为宜。最后用苏木素复染后应让流水彻底冲洗切片，再浸入温水使其充分蓝化，这样DAB染色与背景衬染对照效果较好，有利于免疫组化染色结果的观测。

2 染色过程和结果判读的影响因素

1.3 组织的防脱片、切片、烘片及脱蜡 玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤，尤其需要微波或高压等抗原修复的标本极易造成脱片，其玻片的处理就格外重要，应选用多聚左旋赖氨酸或APES等粘附剂对载玻片进行处理。在日常工作中，我们选用APES对载玻片进行处理，将玻片放入1：50比例丙酮稀释的APES中，停留20-30秒，取出稍停，再入纯丙酮涮去未结合的APES，晾干后使用，可取得极好的防脱片效果。另外，免疫组化切片要求平整、无皱褶、无刀痕，因为皱褶、刀痕处可出现假阳性，切片厚度一般要求为3-4um，要尽可能地薄。实践证明，越是薄而平的切片，越不易脱片。切片在56℃-60℃恒温箱里应充分烘烤，至少烘片1小时才不至于脱片，但温度过高或时间过长抗原容易丢失，故实际工作中，我们把组织切片置于58℃-60℃的恒温箱中烘烤1-2小时或37℃恒温箱中过夜，可使切片牢固而防脱片。

在免疫组化染色中若采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理。如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞会干扰染色结果的判断。一般采用较缓和的方法：0.3% H2O2进行封闭处理，对染色结果没有影响。染色过程中采用的冲洗缓冲液为PBS（pH7.2-pH7.4），加入适量的Tween20可增强冲洗效果。若冲洗不充分，会出现非特异性背景染色，故实际操作中应严格遵守实验冲洗步骤。

第一抗体是免疫组化中最重要的试剂。目前市售的抗体有两种：浓缩型抗体和即用型抗体。浓缩型抗体可小量分装冻存（但应避免反复冻融而影响效价），应用前要在本实验室进行成倍数项实验找出最佳稀释度，也就是最佳的抗体染色和最低的背景着色，还应遵循现用现配的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用，最好应用专门的抗体稀释液来稀释抗体。即用型抗体可直接使用，一般4℃保存有效期为24个月，操作方便，比较适合日常工作使用。合适的孵育时间也是保证良好染色结果的重要因素。大部分一抗的孵育时间为37℃条件下1h，或4℃冰箱过夜最为合适。

免疫组化染色的脱蜡步骤与常规HE脱蜡步骤相同，但免疫组化脱蜡需完全干净，最佳方法是与常规脱蜡分开以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。

图5显示的是不同电源电压下基准电压随温度的变化。由仿真结果可知，1.2 V电源电压下，在-40～110℃的温度范围内，基准电压的温漂系数为24 ppm/℃；常温下，在0.9～2 V电源电压范围内，基准电压的电源电压调整率为0.48%/V。

2.2 实验对照及结果判断 要准确判断免疫组化染色是否成功，必须在染色过程中设立阴性及阳性对照。阴性对照：选择组织中无待测抗原，加载一抗后，观察与一抗有无交叉反应。阳性对照：选择组织中含有待测抗原，加载一抗后，观测与一抗结合的特异性。在实验染色中，阴性和阳性对照切片的实验抗原修复条件必须与待测一抗切片的实验条件完全一致，阴性和阳性对照均取得预期染色结果，本次免疫组化染色结果才是可靠的。

实验染色结果观察判断中，真阳性与假阳性的判定需要丰富的经验，真阳性染色结果应表达在预期对应的组织结构中，定位清晰准确；假阳性一般出现在非预期对应的组织中。个别抗体偶尔出现定位异常，如CD20（L26）偶尔见核表达[5]，部分淋巴瘤中可以出现上皮膜抗原（EMA）的表达，均是可以的。

3 结语

综上所述，影响免疫组化染色质量的因素及环节众多。正确认识及分析这些因素，才能尽可能消除和避免这些因素对免疫组化染色质量的影响，如采用10%中性福尔马林固定液固定组织，使用高温高压抗原修复方法及适当的抗原修复液，选择合格的免疫组化试剂及恰当的染色方法，设立正确的实验对照，并严格按照操作规范进行实验操作，才能获得令人满意的免疫组化染色结果，使免疫组化技术真正成为精确可靠的临床病理辅助诊断手段。

[1]许良中.实用肿瘤病理方法学[M].上海:上海医科大学出版社,1997.

[2]Tarlor C R.The total test approach to standardization of im munohistochemistry[J].Arch Pathol Lab Med,2000,124:945 -951.

[3]Battifora H,KopinskiM.The influence of protease digestion and duration of fixation on the immuno-staining ofkeratins:a comparison of formalin and ethanol fixation[J].The Jou-rnal ofHistochemistry and Cytochemistry,1986,34:1095-1100.

[4]Elias J,Margiotta M.Low temperature antigen restoration of steroid hormone receptor roteins in routine paraffin sections [J].Histotechnol,1997,20(2):155-158.

[5]纪小龙,施作霖.诊断免疫组织化学[M].北京:军事医学科学出版社,1997.

Factor’s Analysison Influencing the Staining Qualitiesof Immunohistochem istry

GU Dong-mei，LIUWei
(DepartmentofPathology，TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，SuzhouJiangsu215006，China)

There are various influencing factors in operating technicalskillof immunohistochem istry，which directly affectstaining qualitiesof immunohistochem istry.Practicable and effectivemethodsmustbe taken to obtain the satisfied results of immunohistochem istry and thus provide reliable evidence for the pathologicaldiagnosis.

immunohistochem istry；staining quality；influencing factor

R446

A

1671-0142（2011）06-0066-03

顾冬梅（1977-）,女,江苏苏州人,主管技师,在读硕士研究生,研究方向为病理与病理生理学.

（责任编辑 刘 红）