余春开 冯瑞娥

结核病是严重危害人类健康的全球性传染病之一，我国是结核病高发区，且近年结核病发病率有逐年增加的趋势;另外由于AIDS的蔓延和各种原因引起的免疫缺陷，导致不典型结核分枝杆菌感染的发病率也逐年增加。早期诊断、早期治疗和合理治疗是治疗结核病的关键。目前临床上常用的结核病诊断方法有细菌学涂片抗酸染色、活检病理诊断和体液或组织培养。细菌学涂片和活检病理抗酸染色找到抗酸杆菌可以确诊结核，但是阳性率很低，而且不能区别结核杆菌和不典型结核杆菌。另外麻风杆菌也可以表现为抗酸染色阳性。体液或活检组织的分枝杆菌培养阳性可明确诊断结核及菌型，但是培养时间长，且阳性率非常低。虽然新的培养法BACTEC法显著缩短了培养、菌型鉴定结果的报告时间，但由于该法使用放射性底物而使它的应用受到了限制。并且有些类型分枝杆菌不能在培养基中生长。以上这些方法都不能满足临床对结核病早期诊断和早期治疗的要求，很多结核病病人不能及时的得到确诊而延误病情;甚至有部分病人被误诊，而接受了错误的治疗使病情加重。因此要求我们寻找快速有效的检测方法。利用分子生物学方法检测分枝杆菌DNA特异性高，与培养法具有可比性，且敏感性较高。本文对各种分子生物学技术在结核杆菌和不典型分枝杆菌诊断中的研究进展及在石蜡包埋组织中的应用做简要综述。

一、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)

PCR技术被广泛应用于医学和生物学领域。该技术的优点是其强大的扩增能力，能把极微量的DNA扩增到琼脂凝胶电泳能检测到的水平;缺点是微量的污染DNA经扩增后能使结果呈假阳性。因此避免污染对于实验成功是非常关键的。严格实验室管理、规范操作和选择特异性好的引物都有助于减少假阳性的发生。

为了提高PCR诊断的敏感性和特异性，很多学者通过改变实验具体操作或使用不同材料而建立了改良PCR方法用于检测分枝杆菌。

1.巢式PCR:相对于普通PCR，巢式PCR的敏感性和特异性更高。此技术使用两对PCR引物扩增完整的片段，第一对PCR引物(又称外引物)扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，又称内引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增，因此扩增结果更具有特异性。临床标本如痰、胸水、脑脊液等巢式PCR检测的敏感性和特异性均较好。有学者尝试在福尔马林固定石蜡包埋组织中用巢式PCR检测分支杆菌［1-6］。Alcantara-Payawal等［3］以IS6110序列引物分别用传统PCR和巢式PCR检测石蜡组织的结核杆菌，结果显示巢式PCR的敏感性明显高于传统PCR。Park等［4］用巢式PCR检测81例临床怀疑结核的石蜡组织，巢式PCR结果与抗酸染色结果比较显示巢式PCR很大程度上提高了石蜡组织诊断结核的阳性率。Stephan Schulz等［6］对190例怀疑结核的石蜡组织利用HSP 65序列进行巢式PCR检测，结果190例中119例分枝杆菌DNA检测阳性，其中71例符合典型结核杆菌;41例发现不典型分枝杆菌DNA。而AZOV等［5］结合HSP 65和IS 6110序列对46例石蜡包埋组织进行巢式PCR检测，对20例抗酸染色阳性临床最终诊断结核的病例敏感性为100%，且检测结果对结核杆菌复合群和鸟型分枝杆菌均特异。而26例抗酸染色阴性不明原因的坏死性肉芽肿性炎病例，其中9例巢式PCR结果符合结核杆菌，4例符合不典型结核杆菌。巢式PCR是检测石蜡组织结核杆菌的简单快速有效的方法，且同时能鉴别结核杆菌和不典型结核杆菌。

2.PCR-免疫层析法:把PCR与免疫层析法相结合。免疫层析法由三部分组成:浸渗有胶体金和鼠IgG的玻璃纤维丝区;涂有抗洋地黄、抗异硫氰酸荧光素和抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜区;以及用于吸取缓冲液的增厚滤纸区。标本经PCR扩增后，把样品滴到检测板上，数分钟后即可判读结果。Suzuki等［7］建立了PCR-免疫层析法检测临床怀疑结核的138例痰标本，38例培养(+)涂片(+)的病例PCR-免疫层析法阳性率100%，14例培养(+)而涂片(-)或(±)的病例阳性率分别为9.1%和66.6%。Soo等［8］用IS 6110和Rv3618序列巢式PCR-免疫层析法直接检测1500例临床痰标本，可诊断并鉴别结核杆菌复合群和结核杆菌。免疫层析法是一种简单的可靠的方法，与酶联免疫吸附法和凝胶电泳相比，5 min内就可肉眼判读结果。PCR-免疫层析法是一种快速检测方法，且敏感性和特异性与培养法相近，不需要特殊的技术和仪器。

3.多重PCR:是指在同一PCR反应体系中，加入多对不同引物，根据它们的退火温度的不同进行PCR扩增，而在同一反应体系中得到不同的PCR产物，经凝胶电泳后出现多条条带。侯瑞生等［9］以IS 6110及HSP 65为PCR引物对临床标本培养分离株进行多重PCR检测，结果显示多重PCR体系检测结核杆菌DNA的灵敏性最低为30～210个结核杆菌，对结核病病例和对照标本检测的灵敏性为94.6%，特异性为100%。Klemen等［10］提出三步法进行筛选性诊断:第一步用IS6110引物PCR检测结核杆菌DNA，如果阳性就没有必要进行第二和三步;如果阴性，进入第二步;第二步用HSP 65引物PCR检测分枝杆菌病，如果阳性，进入第三步进一步分型;第三步加入多条特异性引物进行多重PCR检测不典型分枝杆菌，鉴别出不同菌型。也有学者报道多重PCR用于石蜡组织中结核杆菌的检测，李子玲等［11］应用三对具有特异性的寡核苷酸引物直接对石蜡组织进行多重PCR扩增。这三对引物HSP 65、IS 6110及人类β2-珠蛋白基因的部分序列。此种多重PCR方法特异性和敏感性高，且可以鉴别结核分枝杆菌复合体及非结核分枝杆菌DNA。多重PCR的优点是可以根据需要选择不同菌株特异性引物进行检测，临床上有部分病例是属于两种或两种以上分枝杆菌混合性感染或者夹杂其他特殊感染，利用多重PCR检测可以避免混合性感染病例被漏诊。

4.定量PCR:是在定性PCR基础上改进扩增方法并采用新的检测方法进行定量。实时荧光定量PCR扩增时加入一对引物和一个特异性的荧光探针，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Hillemann等［12］采用普通PCR和实时PCR方法分别检测石蜡组织的结核杆菌DNA，结果24例临床诊断结核的病人，实时PCR结核杆菌检测的敏感性为66.7%(16/24)，而普通PCR的敏感性只有33.3%。近年有学者把定量PCR与巢式PCR或多重PCR相结合，提高了敏感性和特异性。Takahashi等［13］建立了实时定量PCR和巢式PCR相结合的技术检测结核杆菌，这种技术结合了巢式PCR高敏感性和定量PCR能精确定量的优点，避免了巢式PCR费时费力且容易出现污染的缺点。Richardson等［14］建立了多重实时定量PCR，即结合多重PCR和实时定量PCR技术，他们采用此技术对314例临床标本培养分离株进行检测，结果与培养法比较敏感性和特异性达到99%，且因为应用多对特异性引物，可快速对分枝杆菌进行分型。实时定量PCR是一密闭系统，减少了实验室环境对其的污染，大大降低了假阳性率，与常规PCR相比，特异性更强，自动化程度更高。

5.Amplicor PCR:是由瑞士Roche公司开发研制的标准化、商品化试剂盒，该试剂盒有三个不同的小盒:标本处理盒、扩增盒和鉴定盒。应用种特异性探针可对结核分枝杆菌和不典型分枝杆菌进行菌种鉴定。不少文献报道Amplicor PCR对于检测临床标本(包括痰液、胃内抽吸液)的分枝杆菌是一种快速、特异的诊断方法，且敏感性与传统的培养法相近［15-17］。Peter-Getzlaff等［18］建立了新的Amplicor PCR引物，生物素标记的引物KY18和K75用于直接检测不典型分枝杆菌(其中包括堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌等)。痰涂片阳性和阴性病例的敏感性分别为100% 和47.9%，特异性为97.7%。Oh EJ等［19］利用分枝杆菌生长指示管和罗氏Amplicor PCR系统分别检测和鉴定分枝杆菌，两者的敏感性和特异性均较高，并提出两者结合是临床快速诊断结核杆菌和不典型分枝杆菌非常有用的方法。Amplicor PCR是一种快速检测方法，具有高度敏感性、特异性和可重复性，而且操作简单，无需昂贵设备，无放射性污染问题。

二、连接酶链反应(the ligase chain reaction，LCR)

LCR与PCR技术相似，是近年来发展起来的新分子生物学技术。利用DNA连接酶特异地连接双链DNA片段，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。LCR的引物是两对完全已知的互补的引物，引物长度为20～26个，以保证引物与靶序列的特异性结合，因此可准确检测基因序列中单个基因突变。另外该扩增系统是完全密闭的，污染少。但是LCR的DNA扩增技术较PCR慢，在检测微量靶DNA时也不及PCR。用LCX诊断试剂盒对临床标本进行LCR扩增，LCR诊断结核的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均较高，可用于临床标本的筛查［20-23］。Patzina等［24］提出利用LCR技术结合抗酸染色和抗BCG免疫组化，可提高外检石蜡组织的结核确诊率。

三、单链构象多态性分析(single-strand conformation polymorphism，SSCP)

SSCP技术是在PCR的基础上发展起来的，检测PCR反应产物中单碱基突变。其原理是DNA单链若碱基序列不同，其空间构象也会不同，若某一片段的碱基序列发生突变，甚至是单个碱基的变化(点突变)，那么其单链的空间构象也会发生变化。PCR扩增产物经变性后可产生两条互补的单链，快速复性后，经凝胶电泳、显色分析结果。由于不同构象的DNA片段具有不同的迁移率，因而在凝胶上会显现出不同的带型。与结核标准株的带型进行比较，即可判定待测样品是否存在突变。有不少文献报道关于SSCP用于结核杆菌基因的突变和耐药性的快速检测［25-27］。该方法简单、快速，不需要特殊的仪器，成本较低。检测耐药基因有很强的特异性和较高的敏感性，与常规耐药性测定方法有很高的符合率，结果容易观察，而且能长期保存，又可同时分析多个样本，很适用于临床检测。不足之处是电泳条件要求较严格，只能用于确定有无基因突变而不能确定突变的部位和性质。

四、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)

PCR-RFLP技术是PCR和限制性内切酶相结合的技术。PCR扩增产物经限制性内切酶消化后，进行凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性。因此PCR-RFLP技术可用于鉴定分枝杆菌菌种。另外当PCR扩增产物的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，就导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，因此PCR-RFLP技术也用于分枝杆菌的基因突变和耐药性检测。Agacayak等通过对65 Ku蛋白基因的PCR产物进行限制性酶切分析，能准确检测出结核杆菌的属内归属。Mokrousov等［28］报道用RFLP检测到结核杆菌katG315和rpoB531的基因突变。此法特异性较高，但只能分析已知序列特定位点的基因突变，且此种技术操作复杂且费时间。

五、链置换扩增反应(strand displacement amplification，SDA)

SDA是一种等温的体外DNA扩增方法，利用限制性内切酶HincⅡ在半磷酸巯基化识别位点的未保护链上产生一个缺口，然后在外切酶活性丧失的DNA聚合酶I大片段的作用下，从引物切口处向3端延伸，合成的新链可将切口下游区的DNA链取代，被替换的DNA链反过来又可以作为模板，与引物结合，并在HincⅡ作用下产生切口后，又产生一条新链和一条取代链，如此往复循环，从而达到指数扩增的效果。扩增产物经生物素标记DNA探针杂交后应用化学发光酶联免疫试验进行检测，其检测纯化DNA低限为5～50个基因拷贝数。谭耀驹等［29］用SDA技术直接检测临床标本如痰、胸水和脑脊液，实验中应用BDProbeTec ET分枝杆菌测试系统(美国BD公司)和MTBC直接检测试剂盒，结果显示敏感性高于FQ-PCR，而特异性与FQ-PCR相近。Johansen等［30］用SDA技术直接检测石蜡包埋组织，BDProbeTec ET检测结核杆菌的敏感性为90%，特异性为100%。该检测方法需要特殊仪器——荧光分光光度计，因此限制了在临床的广泛应用。

六、基因芯片技术(Gene Chips)

基因芯片的基本原理是将大量已知序列的寡聚核苷酸探针固定在玻璃等支持物上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。该法可以同时一次性完成对样品的多个序列进行检测和分析。基因芯片技术具有快速、高效的优点，可用于诊断分枝杆菌混合感染等复杂病例。1998年，Gingeras等［31］首次应用高密度寡核苷酸阵列对10种121株同时鉴定分枝杆菌菌种和结核分枝杆菌耐利福平基因rpoB突变。利用结核分枝杆菌rpoB基因保守区705bp特异核苷酸序列探针与基因芯片杂交。1999年Troesch等［32］开发出首块结核病相关芯片，包括2部分，一部分是在结核分枝杆菌有种间多态性的16S rRNA基因片段，借以鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌;另一部分则用于分析耐利福平菌株rpoB基因突变的发生情况，可用于结核分枝杆菌对利福平耐药性的快速检测。Mikhailovich等［33］用基因芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因的点突变和基因重排来判定结核分枝杆菌对利福平的耐药性，在利福平耐药菌株中检出30个DNA突变体(约占所有耐药模式的95%)，检测时间缩短到1.5 h。该技术最大的优势在于能够同时分析成千上万个基因。使用芯片技术检测结核杆菌、菌种鉴定、研究耐药基因以及基因组比较分析有灵敏快速、特异性高等特点，少量的DNA足够进行芯片检测，无须进行培养，具有巨大的发展潜力。但由于基因芯片制作复杂，且需要昂贵的特殊仪器而限制了它在临床应用上的普及。

七、转录介导扩增反应即基因探针扩增直接试验(AMTDT)

由DNA介导的等温rRNA扩增法，扩增子应用吖啶酯标记的化学发光探针进行核酸杂交保护实验，通过照度计检测杂交探针的相对发光值，以RLU≥3×104判定为阳性。该rRNA序列在核酸中存在2×103拷贝数，应用AMTDT可使特异性靶rRNA序列扩增109倍。Ruiz-Manzano等［34］利用AMTDT扩增试剂盒直接检测石蜡组织中的结核杆菌，对AMTDT和LCxMTB两种检测方法进行比较，两者的敏感性分别为52.6%和63.2%，两者同时使用时阳性率达80.7%。

八、杂交信号放大方法(hybridization signal amplification method，HSAM)

HSAM是一种新的结核分枝杆菌分子检测方法，利用Dynal磁珠杂交分离靶基因省去了DNA提取步骤，使得检测过程简便易行，可在数小时内完成;自组装的纳米颗粒作为报告信号的结合载体，拥有数量巨大的亲和素位点，增加了报告信号(Biotin-FITC)数量，放大了信号强度，提高了检测的灵敏度。王海河等［35］用HSAM法检测合成的IS6110靶基因、结核分枝杆菌标准菌株、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌，结果显示HSAM最少能检测到结果表明HSAM最低可检测10个靶基因和结核分枝杆菌，与PCR方法灵敏度相近，标准菌株检测结果阳性，大肠埃希菌和表皮葡萄球菌均为阴性。并用HSMA直接检测124份临床结核患者标本(包括痰、胸水和腹水)，与培养法进行对比，敏感性为87.7%，特异性92.2%［36］。HSAM具有高灵敏度、高特异性及操作简便快速等特点，可肉眼直接观察检测结果。检测过程简便快捷，不需要昂贵的设备。

早期诊断是结核病治疗的关键。分子生物学技术是诊断结核快速、有效的方法，特异性和敏感性均较高，能够满足结核早期诊断的要求，因此分子生物学技术诊断结核在临床应用上有良好的前景。重复性好、自动化程度高且结果可靠的分子生物学诊断技术的研究是今后的重点研究方向。

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