林 虎,李庆勇,蒋知新,张鋆歆,彭 凌,杜 平,张清华△,高 毅

(1.解放军第三〇五医院老年病中心,北京 100017;2.南方医科大学珠江医院肝胆二科,广州 510262)

大量功能好的肝细胞是生物人工肝支持系统(bioartificial liver support system,BALSS)的核心[1],所以探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法,建立一个肝细胞库是BALSS推广的基础[2]。UW液(University of wisconsin solution)、CS液(Celsior solution)和 HTK液(Histidine-tryptophan-ketoglutarate solution)是目前较常用的供肝保存液,但供肝的保存混杂有缺血再灌注损伤的影响,不能完全反应对肝细胞的保存效果[3]。C3A细胞是一种人源性高分化肝肿瘤细胞,具备氨基清除和清蛋白分泌等功能,以C3A细胞为生物材料的体外肝辅助装置(extracorporeal liver-assist device,ELAD)系统已经进入了Ⅲ期临床试验[4]。但C3A细胞分别于 UW液、CS液、HTK液低温保存后细胞存活率及功能有无差异,是否满足BLASS的需要未见相关文献报道。因此,本研究分别采用UW液、CS液和HTK液于4℃常规低温保存生物人工肝用C3A细胞72 h,以比较其保存效果。

1 材料与方法

1.1 材料 C3A细胞(ATCC,美国);DM EM/F-12培养基、优级胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素溶液(×100)、0.25%胰酶及PBS缓冲液(Invitrogen,美国);UW 液(Bristol-myers quibb);50 mL培养瓶、6孔培养板(Costar Corning);氯化铵(Sigma);人清蛋白ELISA试剂盒(R&D,美国),Mode1450型酶标仪(Bio-Rad,美国);CK2型倒置显微镜(Olympus,日本);Live/Dead试剂盒(Invitrogen,美国);乳酸测定试剂盒(Boehringer Mannhein),Du530型分光光度仪(Beckman,德国);DXC800型全自动生化仪及FACScan型流式细胞仪(Beckman coulter,美国);MIR-151型微电脑程控低温培养箱-10.1～60.1℃及MCO-175型二氧化碳培养箱(SANYO,日本);海尔智能温度记录仪-100.1～120.1℃。超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司)。

1.2 分组 C3A细胞悬液分3组(n=8):UW液保存组(UW液组)、Celsior液保存组(CS液组)、HTK 液保存组(HTK 液组)。

1.3 细胞培养 取C3A细胞约 1×106个,接种到50 mL培养瓶,所用培养基为DM EM/F-12加10%FBS及1%青霉素/链霉素溶液;将培养瓶置于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱内培养;每24 h换液1次,倒置显微镜观察直至内壁长满。……