付 俊,缪时英

中国医学科学院北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京 100005

哺乳动物的精子发生是一个复杂的细胞分化过程,其依赖于一个真正的干细胞群体,它们具有自我更新和产生后代分化为精子的能力[1]。精子发生按其顺序,大致包括3个阶段:第1阶段是精原干细胞经有丝分裂、分化发育形成初级精母细胞;第2阶段是初级精母细胞经第1次减数分裂形成次级精母细胞,再经第2次减数分裂形成单倍体圆形精子细胞;第3阶段是精子细胞变态,包括顶体发生、核浓缩拉长、尾形成,多余胞质脱落,最终形成具有头、颈、尾几个结构的高度分化的精子[2-3]。

根据精子的发育阶段和形态,一般将精子发生分为精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞等几个阶段。很多涉及到精子发生的蛋白质在各个阶段进行精细的调节[4-6]。在研究这些蛋白质的功能前,先检测这些蛋白质在精子发生过程中的定位以及随着精子发生其定位是否有所变化,对于分析这些蛋白质在精子发生过程中的功能具有重要的作用。以往的研究者常采用睾丸切片免疫组织化学或者免疫荧光的方法,来检测某些蛋白质在精子发生过程中的定位[7-8],但睾丸中各种类型、各个阶段的细胞有序而又紧密地排列在一起,欲观察蛋白质在精子发生的某个阶段中较为精细的定位比较困难。本研究拟建立一种简单可行的研究精子发生过程中蛋白质定位的方法,以期为进一步研究其功能打下良好的基础。

材料和方法

材料 ICR品系健康雄性小鼠,购自维通利华实验动物公司;细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)购自瑞士Roche公司,顶体特异染料异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的花生凝集素 (peanut agglutinin,PNA)购自美国Sigma公司;山羊血清、封片剂购自中杉金桥生物技术公司。

生精细胞的分离 将小鼠断颈处死,打开腹腔找到睾丸,将睾丸取下,去除脂肪组织及白膜,留下曲细精管;在磷酸缓冲液中洗1次,并去除血管;将曲细精管与2.5 mg/ml的胶原酶Ⅰ及20μg/ml的DNA酶Ⅰ混合,于35℃水浴20～30 min细精管分离为单个而不黏连;用磷酸缓冲液洗2次,每次颠倒混匀后静置,去除上清;用剪口的枪头反复吹吸,将细胞打散后,室温静置。细胞因重力原因分为3层,分别取各层中的细胞观察细胞种类是否齐全,一般取中间一层细胞种类较为齐全且为较分散的细胞层,取出稀释到合适的浓度,涂片于载玻片上。

荧光染色 涂片自然晾干,用4%多聚甲醛固定液室温固定10～15 min;磷酸缓冲液漂洗3次,每次5 min。室温下用0.5%TritonX-100的磷酸缓冲液处理涂片10 min;磷酸缓冲液漂洗3次,每次5 min;以3%BSA封闭,37℃,30 min;磷酸缓冲液漂洗3次 ,每次5 min。以1μg/ml浓度的 DAPI染细胞核,室温5 min。再以20μg/ml的PNA染精子顶体,室温避光染色30～60 min;磷酸缓冲液漂洗3次,每次5 min;去离子水漂洗去盐2次,每次5 min。取10μl封片剂滴在载玻片上,盖上盖玻片,四周用指甲油封边;用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并照相。

结 果

精原细胞的形态 精原细胞的细胞核小而致密,染色质多集中在靠近核膜的区域,顶体染料PNA染色为阴性 (图1)。

精母细胞的形态 细胞核较大,染色较浅,顶体染料PNA染色依然为阴性 (图2)。

早期圆形精子细胞的形态 和精母细胞相比,圆形精子的细胞核比较小,可见细胞核的一侧有很小的顶体小泡开始生成;随着圆形精子细胞的发育,顶体小泡也开始生长,其覆盖细胞核表面的比例越来越大 (图3)。

晚期圆形精子细胞的形态 晚期的圆形精子细胞,细胞核的大小和形态与早期圆形精子细胞差不多,但是随着顶体的发生生长,顶体已覆盖细胞核表面接近于50%的区域 (图4)。

早期长形精子细胞的形态 进入长形精子时期的精子细胞,细胞核开始浓缩拉伸,不再维持之前的圆形,随着细胞核开始不对称,顶体也开始偏向于细胞核的一侧,精子细胞的极性,即腹侧面和背侧面开始逐渐形成 (图5)。

晚期长形精子细胞的形态 晚期长形精子的细胞核继续变形,接近于成熟的精子,顶体完全覆盖了细胞核的背侧而在腹侧没有顶体 (图6)。

讨 论

睾丸的结构比较特殊,各种形态的生精细胞、体细胞在其中有序而又紧密地排列,这种紧密排列关系,使观察某个时期细胞较为精细的结构变得困难。针对这一难点本研究采用同时利用胶原酶和DNA酶消化曲细精管的方法,快速地将小鼠睾丸中紧密排列的各种类型的细胞分离开,得到种类齐全的各种生精细胞。将这些细胞涂片于载玻片上后,使细胞平铺于载玻片上,而不是紧密地排列,从而利于观察。然而在普通的光学显微镜下,不能明确的分辨各种生精细胞。经特异的荧光染料DAPI和PNA染色后,通过共聚焦显微镜扫描,可以清晰地观察到小鼠曲细精管中生精细胞的细胞核和顶体的发育过程。生精细胞的细胞核发育从精原细胞开始经历了小而深染色,大而浅染色,浓缩变小、变形,最终形成了具有极性的成熟的细胞核;生精细胞的顶体发育从早期的圆形精子细胞开始,在细胞质中生成顶体小泡并靠近细胞核,沿着细胞核延伸扩大,最终随着细胞核的变形,形成了覆盖其一侧具有极性的特征性结构[5-6]。细胞核的变形和顶体的形成是精子发生过程中的标志性事件。正是通过这些过程中的形态特征可以区分处于不同时期的精子细胞。在这一过程中,如果对某个目的蛋白质进行染色,通过顶体的形态和细胞核的形态来判断生精细胞所处的阶段,就可以分析出这个目的蛋白质在某个生精细胞阶段的定位。将各个生精细胞阶段的定位联系在一起,就可以分析出这个蛋白质在生精过程中定位的变化,进而对其功能作用有所提示。

这种方法的使用也有局限性,其较适用于检测蛋白质在精子发生过程中某个时期细胞中的定位,比如分析蛋白质与精子细胞变形、顶体发生是否有关等。但由于操作过程中已经打破了细胞和细胞之间的连接,因此不适用于分析生精上皮中各个细胞间的连接关系。

图1 精原细胞的形态观察Fig 1 Morphological observation of spermatogonia

图2 精母细胞的形态观察Fig 2 Morphological observation of spermatocyte

图3 早期圆形精子细胞的形态观察Fig 3 Morphological observation of early round spermatids

图4 晚期圆形精子细胞的形态观察Fig 4 Morphological observation of late round spermatids

图5 早期长形精子细胞的形态观察Fig 5 Morphological observation of early elongated spermatids

图6 晚期长形精子细胞的形态观察Fig 6 Morphological observation of late elongated spermatids

[1]Yoshida S.Stem cells in mammalian spermatogenesis[J].Dev Growth Differ,2010,52(3):311-317.

[2]Phillips BT,Gassei K,Orwig KE.Spermatogonial stem cell regulation and spermatogenesis[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2010,365(1546):1663-1678.

[3]Hinrichsen-Kohane AC,Hinrichsen MJ,Schill WB.Molecular events leading to fertilization-a review [J].Andrologia,1984,16(4):321-341.

[4]Bettegowda A,Wilkinson MF.Transcription and post-transcriptional regulation of spermatogenesis[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2010,365(1546):1637-1651.

[5]Hermo L,Pelletier RM,Cyr DG,et al.Surfing the wave,cycle,life history,and genes/proteins expressed by testicular germ cells.Part 1:background to spermatogenesis,spermatogonia,and spermatocytes[J].Microsc Res Tech,2010,73(4):241-278.

[6]Hermo L,Pelletier RM,Cyr DG,et al.Surfing the wave,cycle,life history,and genes/proteins expressed by testicular germ cells.Part2:changes in spermatid organelles associated with development of spermatozoa [J].Microsc Res Tech,2010,73(4):279-319.

[7]Koike S,Noumura T.Immunohistochemicallocalization of insulin-like growth factor-Ⅱin the perinatal rat gonad [J].Growth Regul,1995,5(4):185-189.

[8]Nakanishi S,Fujii A,Nakade S,etal.Immunohistochemical localization of inositol1,4,5-trisphosphate receptors in nonneural tissues,with special reference to epithelia,the reproductive system,and muscular tissues[J].Cell Tissue Res,1996,285(2):235-251.