赵 娟 王立浩 毛胜利 张正海 云兴福 张宝玺*

（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特010019）

近年来，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）对辣椒（Capsicumm annuumL.）的危害日益严重，其主要通过蚜虫进行传播，可引起辣椒系统花叶、矮化、皱缩，导致果实畸形，严重减产（Xu & Barnett，1983）。培育抗黄瓜花叶病毒的辣椒新品种是辣椒育种的目标之一（张宝玺 等，2005）。分子标记技术的成熟为辅助辣椒抗病育种提供了条件，可通过基因定位构建遗传图谱，在此基础上分离克隆抗病基因，进一步了解病害的发生机制（张丽英 等，2008）。

辣椒分子标记和数量遗传的研究近年逐步发展起来，国外研究者采用RFLP、RAPD、AFLP等分子标记技术得到了一些辣椒抗黄瓜花叶病毒的QTL位点（Caranta et al.，1997；Ben Chaim et al.，2001；Caranta et al.，2002），国内研究者在辣椒抗疫病（安静 等，2007）、辣椒红素含量（张芳芳 等，2010）的QTL定位方面取得一定进展。但关于辣椒抗黄瓜花叶病毒QTL定位的研究鲜见报道，本试验采用SRAP和SSR分子标记技术相结合，构建辣椒分子遗传图谱，针对辣椒抗黄瓜花叶病毒基因进行QTL定位分析，以期为今后辣椒抗黄瓜花叶病毒育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试辣椒品种 perennial，抗黄瓜花叶病毒，果实指形，朝天，味辣，从法国农业科学院引进；甜椒品种茄门，感黄瓜花叶病毒，果实灯笼形，主要园艺性状优良，来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

试验于 2008年 3～11月在本所进行。采用抗病材料 perennial和感病材料茄门杂交的 F2为作图群体，共146株。F2自交得到F3，共146个株系，每个株系3次重复，每处理10株，共4 380株。

2008年3月播种双亲以及F2群体的146个单株；9月播种双亲以及F3株系，每个苗盘种植6行，每行10株，F3每个株系种植30株，以75-3-1为感病对照，进行室内人工接种抗病性鉴定。

1.2 分子标记筛选

采用CTAB小量法（Fulton et al.，1995）提取双亲、F2的146个单株叶片DNA。SRAP分子标记引物参考 Li和 Quiros（2001）、Riaz等（2001）、Lin等（2003）、Budak等（2004）、王刚等（2004）、雷剑和柳俊（2006）等。SRAP扩增反应体系参考 Li和 Quiros（2001）的方法。SSR分子标记引物参照Sol genomics network上公布的引物（http://solgenomics.net/），共150对（上海生工生物工程技术服务有限公司合成），利用亲本进行引物的筛选。SSR扩增反应体系参照Tam等（2005）的方法，扩增产物在4%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳、银染。将银染后晾干的胶板放置于白光灯箱上，统计多态性条带，与母本茄门带型相同记为a，与父本perennial带型相同记为b，具有共显性的带型记为h，由于各种原因造成的数据不清晰或缺失者记为“-”。在SRAP标记中，F2出现与母本不同的记为c，与父本不同的记为d。

1.3 抗病性鉴定

本试验采用的黄瓜花叶病毒为重花叶株系，该病毒由本所病毒真菌课题组提供。在防虫温室中，待幼苗 3～4片真叶时采用人工摩擦接种法（孙秀东 等，2008）进行接种。接种前，要保证幼苗的生长整齐一致。以75-3-1为感病对照。取已感染黄瓜花叶病毒的三生烟（Nicotiana tobacumcv.Samsun NN）鲜叶，按照鲜叶与0.03 mol·L-1的磷酸缓冲液（pH=8.0）1M∶5V混合。在冰浴中研磨成匀浆，离心过滤得到接种液，接种液现配现用。接种前在辣椒真叶上洒少许过600目筛金刚砂，然后用手指蘸取接种液轻轻摩擦叶面，接种第1、2真叶。接种后用水冲掉叶面上多余的汁液。接种后温度控制在25～30 ℃。第1次接种3 d后进行第2次接种，保证所有单株均接有该病毒。接种20 d后调查发病症状。

病情分级标准参照国家“八五”辣椒抗病育种攻关组的分级标准（李树德，1995）：0级，无任何症状；1级，心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级，系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级，系统重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级，多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9级，植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡。群体抗病类型划分标准参考孙秀东等（2008）的方法，免疫（I）：病情指数=0；高抗（HR）：病情指0.1～5.0；抗病（R）：病情指数5.1～20.0；耐病（MR）：病情指数20.1～40.0；感病（S）：病情指数大于40.0。

1.4 数据分析

根据孔繁玲（2006）的世代对比法计算F2群体的广义遗传力。结合SRAP和SSR分子标记在 F2上的多态性，采用 JoinMap3.0软件构建连锁遗传图谱，取 LOD＞3.0。参照 Ben Chaim等（2001）的方法，将遗传图谱的数据结合辣椒抗黄瓜花叶病毒的接种鉴定结果，运用MapQTL4.0软件中的Permutation Test功能，计算并确定连锁群的LOD值；利用Composite Interval Mapping功能即复合区间作图法进行QTL分析，并分析QTL的加性效应，解释表型变异的贡献率。

2 结果与分析

2.1 SRAP、SSR分子标记多态性

筛选出有差异的SRAP引物426对，选择扩增多态性谱带较清晰，且在父母本间表现差异明显的SRAP引物35对，在F2群体上进行DNA多态性分析，得到83个多态性标记，平均每对引物可以扩增出 2条明显的差异谱带。其中引物Bm8F×K2R在 F2群体上部分单株的多态性见图1。

图1 引物Bm8F×K2R在F2群体上的多态性分析

筛选出有差异的SSR引物56对，选择扩增多态性谱带较清晰，且在父母本间表现差异明显的SSR引物36对，在F2群体上进行DNA多态性分析。其中引物SSR088在F2群体上部分单株的多态性见图2。

2.2 抗黄瓜花叶病毒鉴定结果

从 F3群体的表现来看，各株系间差异明显（图3）。父本perennial整体无明显感病症状，仅个别叶片上产生枯斑；母本茄门感病症状明显，出现花叶、矮化、条斑，部分单株甚至死亡；F1的感病症状介于亲本之间，有枯斑和花叶出现（图4）。

图2 引物SSR088在F2群体上的多态性分析

图3 F3群体接种黄瓜花叶病毒的发病情况

图4 父母本及F1接种黄瓜花叶病毒的发病情况

将F3群体抗病鉴定的病情指数取平均值来反映F2世代146个单株的抗病性（Ben Chaim et al.，2001），就是利用扩大接种鉴定的群体数量来提高鉴定F2抗性的准确性。经统计，F3群体中没有对黄瓜花叶病毒免疫的株系，病情指数在5.1～20.0之间的抗病（R）株系25个，病情指数在20.1～40.0之间的耐病（MR）株系109个，病情指数大于 40.0的感病（S）株系 12个。其中父本perennial的病情指数为4.44，是对CMV高抗的品种，而母本茄门和感病对照75-3-1的病情指数分别为51.11、59.84，均远大于40.0。

由图5可以看出，F3株系抗黄瓜花叶病毒病情指数分布呈正态分布，可用于数量性状的定位分析。

图5 F3株系抗黄瓜花叶病毒病情指数分布图

2.3 广义遗传力分析

如表1所示，辣椒抗黄瓜花叶病毒病的广义遗传力不高，仅为 45.47%，说明抗性可能受到多个基因控制，同时环境因素对黄瓜花叶病毒病的抗性表现有较大影响，在进行抗病育种时应放宽选择标准。

表1 F2的广义遗传力

2.4 分子遗传图谱和QTL定位

利用SRAP分子标记得到83个多态性标记，结合36个SSR多态性标记，应用JoinMap3.0软件进行连锁分析，取LOD值为3.0，得到的分子连锁图谱包括13个连锁群、76个标记位点，其中SRAP标记55个，SSR标记21个。图谱覆盖长度为830.4 cM，标记间平均图距为10.92 cM，连锁群上的标记数在2～16之间，长度处于0～152.2 cM范围内（图6）。经QTL分析，在第1、4、7连锁群上检测到3个QTL位点（表2）。第1连锁群上的QTL位点的LOD值为3.78，在连锁群上支持的区域为136.1～146.1 cM，与其距离最近的两个标记是C9C10-4、B11C16-2，可解释表型差异的贡献率为12.7%；在第4连锁群上的QTL位点LOD值为3.35，在连锁群上支持的区域为57.0～62.0 cM，与其距离最近的标记为B13C10、HpmsE072；在第7连锁群上检测到的QTL位点在HpmsE124和hpms2-2两个标记之间，其LOD值为3.73，支持区域为94.3～109.3 cM；后2个QTL的解释表型差异的贡献率分别为38.8%和11.0%。

图6 辣椒抗黄瓜花叶病毒分子遗传连锁图谱

表2 辣椒抗黄瓜花叶病毒QTL分析

3 结论与讨论

国外对于辣椒抗黄瓜花叶病毒的QTL定位的研究取得了一些成果。Caranta等（1997）通过构建辣椒遗传图谱结合对F1抗病性鉴定，找到3个有关辣椒抗CMV的QTL位点，解释的表型变异在57%以上。之后又利用复合区间作图法在新的亲本组合中找到8个抗CMV的QTL位点，其中1个主效QTL解释的表型变异为45.0%～63.6%（Carahta et al.，2002）。Ben Chaim等（2001）在由180个F3世代单株为作图群体构建辣椒遗传图谱的基础上，采用区间作图法对辣椒抗CMV进行定位研究，得到4个QTL位点，其中1个主效QTL解释的表型变异为16%～33%。

本试验采用复合区间作图法得到3个QTL位点，分布在3个连锁群上，能解释表型变异率分别为 12.7%、38.8%和 11.0%。与第 1个 QTL位点距离较近的标记是 C9C10-4、B11C16-2，与第2个QTL位点距离较近的标记是B13C10、HpmsE072，与第3个QTL位点距离较近的标记是HpmsE124、hpms2-2，在这6个标记中，HpmsE072、HpmsE124和hpms2-2属于SSR标记。通过对本试验中构建的辣椒遗传图谱的第 7连锁群、Lee等（2004）构建的辣椒遗传图谱的第11连锁群、已公布（http：//solgenomics.net/）的辣椒第10和第11条染色体DNA序列、Ben Chaim等（2001）构建的辣椒抗CMV遗传图谱的第11连锁群上的标记进行比较分析发现，可以通过其上的标记将本试验定位的第3个QTL位点与Ben Chaim等（2001）定位的主效QTL位点cmv11.1联系起来。说明本试验定位的QTL位点有可能与Ben Chaim等（2001）定位的QTL位点是同一位点，也可能是同一连锁群上的不同抗CMV位点。这需要进一步加密遗传图谱，寻找更多的抗CMV位点。

本试验中得到3个QTL位点的LOD值分别为3.78、3.35、3.73，QTL数量较少，可能与标记数量偏少和图谱密度不够有关，有待于进一步增加新的标记，丰富遗传图谱。

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