李建辉，刘春国，张 云，刘 明

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001)

H1N1亚型流感病毒导致了2009年流感大流行，并造成0.5%的平均死亡率[1]。目前，疫苗免疫是防控流感最有效的措施，因此针对流行株疫苗的研究是防控流感流行的关键环节。世界卫生组织推荐的方法是“6+2”重配，即以人流感病毒细胞高产病毒PR8株为骨架提供6个内部基因，外部基因选择流行株的HA和NA进行疫苗的研制[2]。

本研究从某甲型H1N1流感疑似患者的咽喉拭子中分离鉴定出一株甲型H1N1流感病毒，利用反向遗传学技术拯救出基因片段全部来源于亲本甲型H1N1流感的重组病毒株(rLM)，然而按照世界卫生组织推荐的方法进行“6+2”重配却未提高重配病毒的产量。将LM株所有片段逐一与PR8株的7个片段搭配构成完整的流感病毒基因组“7+1”重配，比较所得8个重配病毒的血凝价，结果显示rLM的PB1、PA、HA基因显著降低了7+1重配病毒的细胞适应性。筛选到了影响rLM株重配病毒细胞适应性的基因，为进一步改造其成为细胞适应疫苗株奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病毒分离以及PR8的8质粒系统 将2009年10月于哈尔滨某疑似甲型H1N1流感患者的咽喉拭子的浸出液混合双抗后接种9日龄～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，37℃培养48 h，4℃冷藏过夜，收获尿囊液，分装于-70℃保存备用；人流感细胞高产病毒A/PR8/34(H1N1)(PR8)株的8质粒系统由本实验室保存。

1.2 菌种、SPF鸡胚以及细胞系 大肠杆菌TOP10感受态细胞、293T细胞和MDCK犬肾细胞由本实验室保存；……