张瑞华，崔红玉，徐明举，利 凯，陈化兰，王存连，魏 东，李寸欣，徐 彤*

猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)是分节段的单股负链RNA病毒，片段4、5、6和7分别编码HA、NP、NA和M蛋白，其中片段4和6的变异率较高[1-2]。一般认为流感病毒具有宿主限制性，但自然条件下经常发生禽和人流感病毒传染猪的病例[3-5]。自1976年SIV传染给人引起发病和导致死亡以来，该病毒不断在人-猪-禽间传播[6-7]。特别是近年来发生的H5N1、H9N2和H7N7亚型流感病毒直接感染人、导致人死亡的事件，更引起了人们对流感病毒的关注。目前，对流感病毒的研究集中在高致病性流感病毒方面。而本研究对H9N2亚型SIV进行克隆、遗传进化分析及其对小鼠致病性的研究，初步了解该病毒的分子进化特征以及其对哺乳动物的致病性，为进一步研究其对哺乳动物致病机理，尤其是肺损伤的机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株和实验动物 大肠杆菌DH5α由河北北方学院微生物传染病实验室保存；SPF级6周龄～8周龄、雌性BALB/c小鼠和SPF鸡胚购自北京实验动物研究中心。

1.2 质粒、引物及相关试剂 RNA提取试剂OMEGA Bioteck RNA-Solv Reagent、TaKaRa One step RNA PCR Kit(AMV)、pMD18-T Vector以及相关限制性内切酶均购自TaKaRa公司；UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程服务有限公司。引物根据GenBank登录的病毒A/swine/Guangxi/7/2007(H9N2)(CY075030)基因序列设计并由上海生工生物工程服务有限公司合成。

表1 HA、NA、NP和M基因的引物序列Table 1 The primer sequences of HA,NA,NP and M gene of SIV

1.3 病毒分离和鉴定 2008年11月河北省某猪场部分猪出现呼吸困难、流泪、气喘、咳嗽、高热以及全身皮肤淤血症状，部分仔猪死亡，剖检可见肺脏有明显出血变化，肺肿大，气管内有泡沫状液体，疑似为流感病毒引起。……