邵维斌,彭淑娟,夏春英,李 忻,荀 康

(江苏省镇江市第一人民医院肾脏内科,江苏镇江,212002)

腹膜纤维化和大量新生血管形成是导致长期腹膜透析患者腹膜功能衰竭的主要原因[1-2]。随着腹膜透析的进行,非生理性透析液尤其是晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)、葡萄糖降解产物等可引起腹膜间皮细胞逐渐丧失上皮细胞表型,如 E-钙粘蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白等表达下降,同时获得肌纤维母细胞样的特性,如 snail蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达上升,即发生上皮 -间叶转化[3-4],这种发生 EMT的腹膜间皮细胞具有浸润和迁移的能力,因而腹膜间皮细胞 EMT可能是导致腹膜纤维化和新生血管形成的关键环节[4-5],本研究建立了大鼠腹膜间皮细胞 EMT模型来探讨腹膜间皮细胞 EMT在腹膜透析时腹膜损伤过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 原代大鼠腹膜间皮细胞的培养

大鼠腹膜间皮细胞分离、培养及鉴定[6],取第 3代细胞进行实验。

1.2 分组

①对照组:正常的 M199培养基;② 40 mmol/L AGEs组:含 40 mmol/L AGEs-BSA(AGEs牛血清白蛋白,美国 Biovision公司)的M199培养基;③ 80 mmol/L AGEs组:含 80 mmol/L AGEs-BSA的 M199培养基;④牛血清白蛋白(BSA)组:含 80 mmol/L BSA的 M199培养基。第 3代大鼠腹膜间皮细胞经上述各组培养基培养 48、72 h后收集细胞,分别提取 RNA、蛋白。

1.3 实时定量 PCR检测 E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA的表达

细胞总 RNA抽提按 Trizol试剂盒的方法进行,运用实时定量 PCR试剂盒(德国 Qiagen公司)检测,反转录 50℃、20 min,E-cadherin引物序 列 :正 义链 5′-ACCCCTGTTGGTGTCTTT-3′,反义链 5′-TTCGGGCTTGTTGTCATTC T-3′。 α-SMA引物序列:正义链 5′-GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG-3′,反义链 5′-ACGA AGGAATAGCCACGCTCA-3′。 CollagenI引物序列 :正义链 5′-GGTAACGATGGTGCTGTCG G-3′,反义链 5′-GGGACCTTGAACTCCAGCAG-3′。TGF-β1引物序列:正义链 5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCC-3′, 反义链 5′-CTGTGCTATTGCCTTGTC-3′。 VEGF引物序列:正义链 5′-TTACTGCTGTACCTCCAC-3′, 反义链 5′-ACAGGACGGCTTGAAGATA-3′。 GAPDH引物序列:正义链 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′, 反义链 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。 HotStarTaq DNA多聚酶激活 95℃、15 min,E-cadherin反应条件:94℃变性 30 s,55℃退火30 s,72℃延……