艾 明，孙 明，2，李 岱

(1.武汉大学人民医院，湖北 武汉 430060;2.咸宁学院五官医学院)

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种以视网膜光感受器细胞渐进性凋亡以及死亡为特征的遗传性致盲性眼病，且多为双眼发病。目前，全世界约有一百多万人罹患此病［1］，至今缺少有效的治疗方法。而二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)作为人体必需的高度不饱和脂肪酸，近年来它在促进大脑突触细胞及视网膜光感受器细胞的发育方面备受关注。国外已有研究［2］证实:DHA缺乏可导致视觉电生理的改变，视网膜电图反应异常。我们通过观察DHA对RP动物模型视网膜光感受器细胞电镜下形态的影响，为进一步探讨防治RP的新途径提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品及仪器

DHA软胶囊(美国纽曼斯藻油DHA软胶囊婴幼儿装，100mgDHA/粒)，生理盐水，脱脂牛奶，MNU(美国Sigma公司，避光保存，临用前用生理盐水配至5g/L)，2.5%戊二醛，1%锇酸，日立H—600型透射电镜(日本日立公司)。

1.2 实验动物及分组

生后35d的清洁级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠共14只，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，平均体质量(100±5)g，排除眼和全身疾病。将所有动物随机分为3组。A组:正常组，2只;B组:造模组，6只;C组:DHA组，6只。

1.3 实验方法

1.3.1 给药方法

将DHA软胶囊内的藻油抽出，按40mg/kg/d的量给 DHA组大鼠灌胃［3］，先将量好的藻油DHA与脱脂牛奶混合，再灌入大鼠胃内;造模组灌入同样量的脱脂牛奶。每日上午8点给药。

1.3.2 建立动物模型

灌胃15d后将造模组和DHA组SD大鼠按40mg/kg的剂量一次性腹腔注射 MNU［4］。正常组大鼠经腹腔注射同剂量的生理盐水。造模后每日同时间点继续给药。分别在注射MNU后12h、24h、48h用颈椎脱臼法处死动物，取出眼球。

1.3.3 透射电镜观察

将取出的眼球在2.5%戊二醛中固定1周后，改用1%锇酸固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，做超薄切片，日立H-600透射电镜观察。

2 结果

同正常对照组相比，MNU造模后各时间点造模组大鼠视网膜光感受器细胞均发生核深染，染色质浓缩，出现凋亡细胞，外节膜盘疏松卷曲肿胀。随造模时间的延长，视网膜的破坏越严重。造模后第48h，见光感受器细胞明显稀疏、凋亡;而DHA组大鼠视网膜光感受器细胞结构均接近正常(见图1)。

图1 大鼠视网膜光感受器细胞及外节膜盘电子显微镜像

3 讨论

目前，RP的发病机制仍不十分清楚，但其病理过程已经证实为视网膜光感受器细胞的渐进性凋亡，因此，开发抑制光感受器细胞凋亡的药物，延缓RP的病程，是一倍受关注的研究方向。

DHA是人体内不饱和程度最高的必需脂肪酸之一，它不能由自身产生，主要是从食物中直接获取［5］，尤以鲑鱼(沙丁鱼)中含量最为丰富。DHA的作用及其广泛，不仅具有抗衰老、抗神经炎性反应，另外还对黄斑变性、阿尔兹海默病、帕金森病以及其它一些神经变性性疾病都有预防作用［6］。Hoffman DR 等［7］将近几年关于婴幼儿补充DHA的随机对照试验汇集起来发现:大多数研究表明婴幼儿的视功能与饮食中DHA的含量密切相关，食用DHA含量高的配方奶的婴儿其视觉诱发电位(VEP)要比食用不含DHA配方奶的婴儿表现更好，同时已经有许多专家呼吁将配方奶中DHA的含量提高到母乳中的水平甚至更高。Rotstein等［8］也发现氧化剂百草枯加入培养的光感受器细胞中，能破坏线粒体膜的完整性，导致光感受器细胞发生凋亡;然而添加DHA后可以抑制光感受器细胞的凋亡。目前已经有研究发现［9］DHA是通过在体内被转化为内源性神经保护介质D1(NPD1)，进而行使它的神经保护作用——诱导抗凋亡蛋白产生、抑制凋亡蛋白。

MNU对视网膜的损害恰恰是通过诱导光感受器细胞凋亡来实现的，一定量的MNU可以使光感受器细胞变小、染色质浓缩［10］，这虽与人类RP的发病过程有所不同，但其原发部位及凋亡机制是相同的，有助于我们从微观层面观察DHA对视网膜光感受器细胞凋亡的影响。另有研究显示［11］:MNU造模后12h，大鼠光感受器细胞见少量TUNEL细胞，造模后24h，阳性细胞达顶峰，随后会逐渐下降［10］。因此，我们的实验选择造模后12h、24h、48h来观察视网膜光感受器细胞在凋亡早期、高峰期、晚期的电镜下形态。

本研究结果显示:通过一次性腹腔注射一定剂量的MNU建立的RP动物模型，DHA在造模后的观察时间点都可以有效抑制其光感受器细胞的凋亡。此外，DHA属于营养类药物，副作用少，且我们实验中应用的藻类DHA还具有纯度高、不易氧化、易吸收等优点。因此，DHA极有可能成为我们一直以来所寻找的可以延缓RP病程进展的有效药物，但由于大鼠与人的种族差异性，有关DHA的最佳有效剂量、最大剂量等仍需进一步研究。

［1］Barabas P，Cutler PC，Krizaj D.Do Calcium channel blockers rescue dying photoreceptors in the Pde6b(rd1)mouse［J］.Adv Exp Med Biol，2010，664:491

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［11］陈金卯，杨锦南，林少春，等.MNU诱导视网膜变性大鼠bax和 bcl-xl的表达及意义［J］.眼科研究，2009，27(10):844