李雪婷，谢勇恩

(川北医学院病理生理学教研室，四川 南充 637007)

MBP-1，又称为c-Myc启动子结合蛋白(c-Myc promoter binding protein)，我们通过实验研究发现人食管上皮细胞在高浓度亚硝酸盐冲击诱导培养后MBP-1呈现下调表达［1］，由于MBP-1可以调控包括c-Myc在内的多个肿瘤相关基因的表达，是一个值得深入研究的调控分子。本研究构建了MBP-1分子真核表达载体并在食管癌细胞株Eca109中实现了高表达，为进一步探讨MBP-1分子高表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响以及以MBP-1分子为靶点的食管癌基因治疗等研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒载体和细胞株

质粒载体pcDNA3.1(+)由本研究室唐恩洁教授赠送。含MBP-1基因的质粒pCMV6-XLM购自Origene公司，食管癌细胞株Eca109购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 主要试剂

PCR扩增试剂、T4噬菌体DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ、质粒提取试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectin2000、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、硝酸纤维素膜、鼠抗MBP-1单克隆抗体、兔抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒均购自晶美生物公司，其余试剂为国产或进口分析纯。

1.3 MBP-1基因的扩增

根据 GenBank中 MBP-1基因序列(GenBank accession number:GU170215)设计一对PCR引物，上游引物序列为:5'-gcaagcttatggatg gaacagaaaataaatctaag-3'，下 游 引 物 为:5'-gcggatccttacttggccaaggggtttctgaag-3'，上下游引物分别引入HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶位点。引物由大连宝生物科技有限公司合成。以质粒pCMV6-XLM为模板建立扩增体系，循环参数为:先94℃预变性3分钟，然后进入循环，94℃ 变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共30个循环，末次循环自动延伸7分钟，扩增完毕后取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并对目的条带进行胶回收纯化。……