里氏木霉40359原生质体制备条件研究

2011-07-09张晓烜李景富王傲雪

东北农业大学学报 2011年8期

关键词：影响

张晓烜，李景富，王傲雪

（1.东北农业大学成栋学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；3.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

菌种选育是纤维素酶生产的基础性工作，里氏木霉是产纤维素酶最好的菌种之一[1]。目前里氏木霉高产纤维素酶菌株的选育方式有：利用高能电子、紫外线、亚硝酸钠、亚硝基胍、硫酸二乙酯处理和原生质体融合等方法，使酶的活力得到很大的提高[2]。原生质体没有细胞壁，对诱变剂反应灵敏，容易得到正突变株，是得到优良菌种的有效方法。所以原生质体的制备研究是有必要且有应用价值的研究。

本文对影响里氏木霉（Trichoderma reesei）40359原生质体制备和再生的条件：包括菌龄、水解酶液的种类及浓度、酶解温度、酶解时间、再生培养基的稳渗剂进行了研究。得到了较好的里氏木霉原生质体制备的条件，为进一步的育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

里氏木霉（Trichoderma reesei）40359 购自于中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

菌丝培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，蒸馏水定容至1 000 mL。

霉菌完全培养基（CM）：1.4 g（NH4）2SO4、5.0 g葡萄糖、 2.0 g KH2PO4、 6.9 g NaH2PO4、 0.3 g MgSO4·7H2O、10.5 g柠檬酸（含两个结晶水）、0.3 g尿素、0.2 g Tween-80、5 mg FeSO4·7H2O、1.6 g MnSO4、1.4 g ZnSO4·7H2O、2.0 mg CaCl2·2H2O、15%蛋白胨，用蒸馏水定容至1 000 mL。

基础培养基：2.8 g（NH4）2SO4、0.6 g 尿素、4 g磷酸钾、40 g葡萄糖、100 g蔗糖、600 mg CaCl2、200 mg MgSO4·10H2O、10 mg FeSO4·7H2O、1.8 mg ZnSO4·7H2O、3.2 mg MnSO4·H2O、4 mg CoCl2·6H2O，配制固体培养基时需加人琼脂17～20 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。

1.1.3 高渗透稳定缓冲液（STC）

0.6 mol·L-1山梨糖醇，1×10-2mol·L-1Tris-HCl，1×10-2mol·L-1CaCl2，pH 7.5，用蒸馏水定容至1 000 mL。