刘妍妍，于长青，王瑞辉

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

植物乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性[1]。研究发现植物乳杆菌具有降低血清胆固醇水平、降低心血管疾病发病率的良好功效[2]。在20世纪70年代，Mann和Spoerry研究发现，长期大量饮用当地野生乳杆菌发酵制品的非洲Masai部落人体内血清胆固醇含量普遍较低[3]。迄今，已有大量实验证实，植物乳杆菌及其相关制品具有降低介质及血清胆固醇的能力[4，5]。

随着物质生活水平的提高，冠心病（CHD）和动脉粥样硬化等心血管疾病成为目前危害人类健康、导致死亡的首要因素。研究表明，血清总胆固醇（TC）水平和冠心病（CHD）等心血管疾病发病率存在明显的相关性。因此，通过益生菌降低血清胆固醇水平和血脂浓度成为近年来研究的热点之一[6]，而发酵乳是益生菌最合适的载体[7]。

原料乳中胆固醇含量在0.298 mg·g-1左右，传统发酵酸奶中胆固醇含量为0.215 mg·g-1左右。实验采用基于体外降胆模型筛选出来的1株具有降低血清胆固醇能力的植物乳杆菌ST-Ⅲ（CGMCC No.0847），与传统酸奶菌种（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）制成复合发酵剂，研究了酸奶的发酵工艺参数，并通过对比实验研究了植物乳杆菌对产品中胆固醇含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白砂糖（市售），纯牛奶（市售），植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌（由黑龙江八一农垦大学畜产品研究室提供），邻苯二甲醛、冰乙酸、浓硫酸、胆固醇、甲醇、氯仿均为分析纯级。

1.2 实验设备

DHP-9272恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），HWS24恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），冰箱（海尔集团），MD100-2电子分析天平（上海森信实验仪器有限公司），DHG-9145A型恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），LRH-280生化培养箱（广东省医疗机械厂），XSP-2CA型显微镜（上海上光新光学科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 植物乳杆菌发酵酸奶工艺流程

1.3.2 植物乳杆菌发酵酸奶操作要点

（1）菌种的活化：在无菌条件下，用移液枪分别吸取1～2 mL保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌，用接种环挑取植物乳杆菌分别接种到鲜乳中，活化至活力稳定。

（2）调制发酵剂：将鲜乳分装于试管中和三角瓶中，每支试管中10 mL，每个三角瓶中100～150 mL，然后在120℃，5 min条件下进行高压灭菌。将灭菌乳冷却至42℃进行接种，接种量2%～3%，充分混匀后，将含有保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌的牛乳放到42℃恒温培养箱中，含有植物乳杆菌的牛乳放到37℃恒温培养箱中，培养4 h，三角瓶中菌种供生产发酵剂用，试管中的菌种放入冰箱内作为原菌种保留。

（3）原料乳杀菌：原料乳加热到60℃后加入8%的白砂糖，待白砂糖溶解后，置于85℃的水浴锅中杀菌30 min。

（4）冷却：将杀菌乳移置冷却水中冷却，当温度降至37～45℃时，在无菌条件下加入5%发酵剂，加入时要不断搅拌，混匀，并活化0.5 min。

（5）灌装：将接种好的乳快速无菌的灌装于150 mL的容器中，容器必须事先干热灭菌，灌装后马上封盖移置42～45℃的恒温箱中培养发酵，发酵2.5～3 h，发酵好的酸奶凝固无流动，无乳清分离，发酵后于5℃下贮藏。

1.3.3 胆固醇含量的测定

采用邻苯二甲醛比色法[8]。

1.3.4 植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌拮抗实验

选用植物乳杆菌与酸乳生产中常用的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为酸奶发酵剂。将以上3种菌按1∶1∶1的比例接种于灭菌的脱脂乳培养基上，放入42℃的培养箱内培养至凝乳，进行镜检。

1.3.5 酸奶制备工艺参数对胆固醇含量影响单因素实验

1.3.5.1 发酵温度对胆固醇含量的影响

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分装在4个250 mL的三角瓶中，加3%的发酵剂，菌种比例为嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1∶2。分别在 37、39、41、43 ℃培养 4 h，测定发酵后的胆固醇含量，选出最佳发酵温度。

1.3.5.2 发酵时间对胆固醇含量的影响

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分装在4支250 mL的三角瓶中，加3%的发酵剂，菌种比例为嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1∶2。在41℃下，分别培养3、4、5、6 h测定发酵后的胆固醇含量，选出最佳发酵时间。

1.3.5.3 接种量对胆固醇含量的影响

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分装在4支250 mL的三角瓶中，分别以1%、3%、5%、7%的接种量，41℃的温度下发酵4 h，菌种比例为嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1∶2。测定发酵后的胆固醇含量，选出最佳接种量。

1.3.5.4 混合菌种比例对胆固醇含量的影响

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分装在4支250 mL的三角瓶中，以3%接种量，菌种比例分别以嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1 在 41 ℃的温度下发酵 4 h，测定发酵后的胆固醇含量，确定最佳菌种比例。

1.3.6 酸奶制备工艺参数对胆固醇含量的影响正交实验

以胆固醇含量为指标，通过L9（34）正交实验，研究不同发酵温度，发酵时间，接种量及菌种比例对酸奶胆固醇含量的影响，确定最佳工艺参数。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and level of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌拮抗实验

显微镜下观察凝乳中发酵剂菌状态发现，3种菌形态清晰，生长良好，并且3种菌基本保持了1∶1∶1的初始比例，这表明3种菌无拮抗，能够互利共生，可以混合作为酸乳发酵剂使用。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 发酵温度对胆固醇含量的影响

不同发酵温度对酸奶中胆固醇含量的影响见图1。

图1 发酵温度对酸奶中胆固醇含量的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on cholesterol content in yogurt

由图1可知，加入复合菌发酵后，不同发酵温度下酸奶中胆固醇含量都低于正常酸奶，但在39℃下胆固醇含量最低，为 0.17 mg·g-1。

2.2.2 发酵时间对胆固醇含量的影响

不同发酵时间对酸奶中胆固醇含量的影响见图2。

图2 发酵时间对酸奶中胆固醇含量的影响Fig.2 Effect of fermentation time on cholesterol content in yogurt

由图2可知，加入复合菌发酵后，不同发酵时间下酸奶中胆固醇含量都低于正常酸奶，但在5 h下胆固醇含量最低，为0.14 mg·g-1，所以最佳发酵时间为5 h。

2.2.3 接种量对胆固醇含量的影响

不同接种量对酸奶中胆固醇含量的影响见图3。

图3 酸奶接种量对酸奶中胆固醇含量的影响Fig.3 Effect of inoculation quantity on cholesterol content in yogurt

由图3可知，在接种量1%～7%范围内，随着接种量的增加酸奶中胆固醇含量下降，接种量在5%以后，酸奶中胆固醇含量变化不明显，所以酸奶发酵的最佳接种量是5%，胆固醇含量为0.172 mg·g-1。

2.2.4 菌种比例对胆固醇含量的影响

不同菌种比例对酸奶中胆固醇含量的影响见图4。

图4 混合菌种比例对酸奶中胆固醇含量的影响Fig.4 Effect of lactobacilli rate on cholesterol content in yogurt

由图4可知，菌种比例为嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1∶2时，酸奶中的胆固醇含量最低，为0.155 mg·g-1，随着菌种比例的变化，酸奶中的胆固醇含量有上升的趋势，所以最佳菌种比例为1∶1∶2。

2.3 正交实验结果

以胆固醇含量为指标，研究发酵温度，发酵时间，接种量，菌种比例对胆固醇含量的影响，实验结果如下。

表2 正交实验结果表Table 2 Results of orthogonal experiment

由实验结果可知四个因素对实验结果影响程度的主次关系是D＞C＞A>B，最优组合为A3B1C1D2，即发酵温度为41℃、发酵时间4 h、接种量3%、菌种比例 1∶1∶2。

2.4 验证实验与对比实验

在最佳工艺条件下发酵酸奶，重复3次，以检验最优工艺参数的降胆固醇的效果，其实验结果见表3。

表3 验证实验结果Table 3 Results of validation experiment

由表3可知，3次重复实验的平均值为0.122（mg·g-1）。

实验又对没有植物乳杆菌参与发酵的酸奶中胆固醇的含量进行了对比测定，对照样品中3组平行样的均值为 0.215（mg·g-1）。

3 结论

利用植物乳杆菌发酵酸奶，最佳工艺条件为发酵温度41℃、发酵时间4 h、接种量为3%、菌种比例 1∶1∶2（嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌∶植物乳杆菌），酸奶具有良好的品质，胆固醇含量为0.122 mg·g-1。

原料乳中胆固醇平均含量为0.298 mg·g-1，由嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌发酵的酸奶中胆固醇含量为0.215 mg·g-1，而添加植物乳杆菌的发酵酸奶胆固醇平均含量为0.122 mg·g-1，植物乳杆菌参与下的发酵工艺可使产品中胆固醇的含量明显降低。

［1］金世琳.乳酸菌的科学与技术［J］.中国乳品工业，1998，26（4）：14-16.

［2］凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］.北京：中国轻工业出版社，1999.

［3］罗冬英，尹传武.乳酸菌制剂对人体保健功效的机理探讨［J］.鄂州大学学报，2002，9（4）：53-54.

［4］赵红霞，詹勇，许梓荣.乳酸菌的研究及其应用［J］.江西饲料，2003（1）：9-12.

［5］田建军.高效降胆固醇乳酸菌的筛选及其在发酵乳中的应用［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2006.

［6］李兴峰，江波，潘蓓蕾，等.产苯乳酸的乳酸菌分离筛选及菌种鉴定［J］.食品与发酵工业，2007，33（2）：1-4.

［7］顾瑞霞，王亚威，骆承庠，等.发酵乳-最新研究动向［J］.中国乳品工业，1999，27（5）：41-45.

［8］耿倩，生庆海，顾瑞霞.邻苯二甲醛3硫酸比色法测定稀奶油中胆固醇含量［J］.中国乳品工业，2004，9（32）：37-38.