李艳平 唐金宝 林志娟 肖伟玲 梁淑娟 (潍坊医学院山东省免疫学重点实验室,潍坊 261053)

葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SpA)是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一类功能特殊的蛋白质,因其能与IgG的Fc区域结合而备受关注。SpA有E,D,A,B,C 5个高度同源的IgG结合结构域,可与人和多种哺乳动物IgG抗体的Fc段非特异性结合,且这种结合不影响Fab片段与抗原特异性结合的免疫活性[1],根据这一特性,SpA不仅用于IgG和单克隆抗体的纯化,还被多种标记物(如过氧化物酶、胶体金等)偶联标记用于免疫测定;因SpA与IgG结合不受种属限制,被称为“广泛二抗”[1]。ZZ亲和肽是源于SpA的D,A,B,C结构域改造而来,Mr仅为14×103,且保留了IgG结合活性[2],本实验利用大肠杆菌表达了C端带有6×His的ZZ亲和肽,经Ni2+亲和纯化并对其生物学活性进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料 含ZZ亲和肽基因的pEZZ18、pUC18质粒及E.coli DH5α、E.coli HB101均为本室保存;PMD18-T载体、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、DL1000 DNA Marker 及蛋白质分子量标准均购自TaKaRa公司;兔IgG抗体、山羊抗兔IgG-HRP(氧化法标记)购自北京中衫金桥生物公司;BSA(IgG Free)购自BBI公司;BCA Protein Assay Kit购自武汉博士德生物公司;His Trap层析柱购自GE Healthcare;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 ZZ亲和肽基因序列的扩增及载体的构建根据ZZ亲和肽基因序列设计引物:上游引物:5′-CCGGAATTCCATGGCGCAACACGATGAAG-3′,下游引物 :5′-CCCAAGCT TTTTATGATGATGATGATGATGATT-CGCGTC-3′,分别设计了EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位点,引物由上海博尚公司合成。以pEZZ18为模板,PCR扩增ZZ亲和肽基因。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳纯化后,连接到PMD 18-T simple vector,转化E.coli DH5α。质粒扩增后测序(委托大连宝生物工程有限公司)。对测序正确的克隆载体经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切回收ZZ基因片段,连接至经同样酶切的pUC 18载体,转化E.coli HB101,构建pUC-ZZ/E.coli HB101工程菌。……