胡友莹 周 鹰 杨 李 王运刚 崔玉宝 (盐城卫生职业技术学院检难医学教研室,盐城 224006)

目前,临床诊断变态反应性疾病主要使用粗提浸液,其成分较复杂,含有变应原、非过敏性或毒性蛋白及其它成分,所以很难进行标准化,且在治疗中长期使用易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应[1]。近10年来,许多尘螨、花粉、动物皮屑、昆虫以及食物变应原的组分被克隆、测序、表达和纯化,部分变应原组分的三维结构被测定,表位基因被确定[2-4]。利用细菌、酵母、昆虫细胞表达体系制备的重组变应原具有与天然变应原组分相似的与IgE的结合力,用于皮肤点刺试验诊断过敏性疾病表现出更好的活性,也为建立新的免疫疗法提供了可能性,包括降低变应原性,将变应原与IgE抑制剂耦连,用于开发预防性的变应原疫苗等[4,5]。

粉尘螨是居室常见变应原,作者曾通过RT-PCR扩增获得了粉尘螨变应原第2组分编码基因Der f 2,测序结果比参考序列多了87 bp(77～163)[5]。尽管酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功,但多次努力也未能成功表达该基因。本次研究重新提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR扩增获得该基因,测序结果表明此基因与参考序列一致,导入大肠杆菌后用IPTG诱导表达成功,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂 BamHⅠ/XhoⅠ、RNAiso Reagent(Code No.D312)、High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Code No.DR027A)、PrimeSTAR○RHS DNA Polymerase(Code No.DR010A)、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、DNA A-Tailing Kit(Code No.D404)、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV807)、DNA Ligation Kit＜Mighty Mix ＞(Code No.D6023)、pMD19-T Simple Vector(Code No.D104)、E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、TaKaRa DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞(Code No.D6023)、Protein marker均购自大连宝生物公司;E.coli BL21(DE3)Stratagene公司生产;pET28a(+)(Kit Lot No.N72770)及Perfect protein marker由Novagen公司生产;PrecisionPlusProtein Standards购自BIO-RAD公司;True blue PEROXIDASE Substrate由Kirkegaard&Perry Laboratories(KPL,Gaithersburg,MD)提供;Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(Code No.D9030A)、CBB-R250 染色 、PVDF 膜 、 Western blot膜封闭液、CBB-R250 染色液购自天根生化科……