魏思东 余 正 李金政 戴卓娅 刘作金 游海波 陈 勇 龚建平

(重庆医科大学附属第二医院肝胆外科重庆市肝胆外科重点实验室,重庆 400010)

目前,脓毒症还有许多病理生理学的机理尚待解决,Kupffer细胞(KCs)被脂多糖(LPS)过度激活而大量分泌炎性介质,是导致器官损伤及死亡的重要原因[1]。吲哚胺 2,3双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)在脓毒症中升高,其升高与疾病严重性和死亡率相关,是一个独立的预测指标[2]。糖皮质激素诱导的TNF受体配体(Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand,GITRL)能增强单核巨噬细胞的功能,刺激巨噬细胞上的GITRL,同样可以以剂量依赖的方式上调TNF-α等细胞因子的表达[3]。糖皮质激素能有效降低细胞因子及小鼠的死亡率,尽管已发现糖皮质激素可通过糖皮质激素受体诱导内毒素耐受[4],但糖皮质激素及与其相关的糖皮质激素诱导的TNF受体配体,对LPS诱导的IDO的作用尚不清楚。本实验旨在探讨GITRL对KCs内LPS诱导的IDO的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胎牛血清购自美国Hyclone公司;Ⅳ型胶原酶、Percoll分离液及大肠埃希杆菌内毒素购自美国Sigma公司;单克隆大鼠抗小鼠F4/80(BM8)抗体、多克隆兔抗小鼠GITRL抗体、多克隆山羊抗小鼠IDO抗体、GITRL siRNA、对照siRNA及转染试剂购自美国Santa Cruz公司;免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司;蛋白提取试剂盒购自上海贝博公司;TNF-αELISA试剂盒购自北京尚柏公司。

1.2 KCs的分离、分组 KCs的分离培养按照文献方法略有改动[5]。6～8周健康BALB/c小鼠,体重20～25克,购自重庆医科大学实验动物中心。小鼠颈锥脱臼处死后,从胸腔剪断后腔静脉,门静脉穿刺,肝脏原位灌注PBS及0.05%Ⅳ型胶原酶,取下肝脏后0.05%Ⅳ型胶原酶进一步消化约40分钟,制成混合细胞悬液,于4℃、498 r/min离心3分钟后将肝实质细胞与非实质细胞分开。……