刘志云 陈志刚

(1.息县卫生职业中专，河南息县464300;2.信阳医学高等专科学校，河南 信阳464000)

近年来，应用电化学发光免疫法检测血循环中的超微量肿瘤标志物是实验诊断肿瘤的主要定量分析方法［1］。甲胎蛋白用于诊断原发性肝癌的价值已得到肯定，但仍有20% ～40%的PHC患者AFP阴性或水平较低。近年来，GP73作为一个新的肿瘤标志物受到了广泛关注，是一个颇具潜力的肿瘤标志物，与肿瘤的发生、发展、转移和预后密切相关。我们对80例PHC患者和60例正常对照组的AFP、AFU、Fer和GP73同步检测，对测定结果进行比较分析，同时观察四种肿瘤标志物单项和四种联合检测对PHC诊断的价值，报告如下。

1 材料和方法

1.1 正常对照组(NC)60名健康献血员，男41例，女19例，年龄20～49岁，收集空腹血清-30℃保存，一并检测。

1.2 原发性肝癌组 参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范》中有关标准，经临床、实验室、病理学确诊的原发性肝癌80例，其中男57例，女23例，平均年龄60.4岁。巨块型29例、结节型25例、弥漫型26例。根据肝癌TNM分期:Ⅰ期7例，Ⅱ期16例，Ⅲ期57例。

1.3 方法 AFP、Fer试剂盒由上海海研医学生物技术中心提供，仪器使用德国ROCHE公司生产的全自动电化学发光免疫分析仪，数据由微机自动处理。AFU采用LX20型生化仪(美国贝克曼公司生产)全自动生化分析仪，试剂盒由珠海金赛尔公司提供，分别设定阳性界定值AFP＞400 μg/L，AFU 5～40 U/L，Fer男 ＞ 240 μg/L 、女 ＞ 150 μg/L。GP73方法:4% ～12% 丙烯酰胺梯度预制胶(NuPage，Invitrogen，美国)，MOPS 电泳缓冲液(Invitrogen，美国)，iBlot快速转膜仪(Invitrogen，美国)，BSA(北京化学试剂有限公司)，抗-GP73羊多抗(Santa Crus，美国)，抗山羊二抗(Santa Crus，美国)，ECL(TheⅡno，美国)。Western印迹测定人血清中GP73蛋白含量:取待测血清加入1×加样缓冲液，100℃灭活8 min。使用4% ～12%丙烯酰胺梯度预制胶和MOPS电泳缓冲液，上样量为每孔10 L，含0.5 L血清。每块胶中均有一道上样为已知标准正常人血清，作为组间对照。电泳结束后使用iBlot快速转膜仪转膜，3%BSA室温封闭1 h，加抗 -GP73一抗(1∶1000)4℃12 h，TBST洗 3遍，加抗山羊二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，TBST洗3遍后加ECL曝光。x光片扫描后使用BandScan 4.30软件分析条带灰度值;待测样品的灰度值与标准正常血清的灰度值的比值为GP73的相对单位，用于统计学分析。GP73值＞10相对单位为阳性。

2 结果

2.1 PHC患者与正常对照组血清AFP、AFU、Fer和GP73水平变化 见表1。

结果显示PHC患者三种标志物均显著高于正常对照组，有统计学意义(P＜0.01)。

表1 血清 AFP、AFU、Fer［ρ/(μg·L-1)］水平变化

2.2 各种肿瘤标志物单项和四种联合检测的敏感性和特异性 见表2。AFP、AFU、Fer和GP73单个肿瘤标志物诊断原发性肝癌的敏感性为72.5%、22.5%、68.8%、75.0%，特异性为 95%、100%、96.3%、95.0%。三种肿瘤标志物联合检测在原发性肝癌诊断中的敏感性和特异性为98.8%、100%，联合检测的敏感性与单项比较有统计学意义(P＜0.01)。

表2 肿瘤标志物单项和三项联合检测的敏感性和特异性

22例AFP阴性PHC患者中有17例Fer值均＞340 μg/L，5例 AFP和 Fer均阴性者 AFU结果有4例阳性。

3 讨论

近年来，有关肿瘤病人血清肿瘤标志物检测越来越为人们重视，因为它是一种无创性诊断，多项标志物同步检测可提高阳性诊断率，并能早期发现病人［2］。GP73 是 Kladney 等［3］从巨细胞肝炎的肝脏cDNA文库中筛选出的一种高尔基体Ⅱ型跨膜糖蛋白，其基因位于9号染色体长臂，全长3042 bp，内含1个1200 bp的开放阅读框，编码400个氨基酸，因在WB显示的相对分子质量7300而得名，又称GOLPH2或GOLM1。GP73蛋白定位于高尔基体顺面，由胞内、跨膜和胞外3个区域构成，其N-末端为胞外段，是与其他蛋白相互作用的主要功能区。研究表明，肝癌患者的肝组织中GP73表达显著升高，且与广泛的肝脏炎症和纤维化程度一致［4］。本文对80例PHC患者进行肿瘤标志物检测发现，PHC患者的AFP、AFU、Fer和GP73水平显著高于正常对照组(P＜0.01)。单项诊断敏感性在22.5%～72.5%，联合检测达98.8%以上，差异有显著性(P ＜0.01)。

PHC患者肝癌细胞产生和分泌AFP渗入癌周围组织进入血液循环，血液中AFP含量极稳定且特异性强，故检测血清AFP已被公认为诊断PHC的重要手段［5］。本组资料表明AFP阳性率为72.5%，还有27.5%左右患者AFP阴性或低含量。由于人血清和人肝脏来源的AFP与胚胎来源AFP之间存在大量共同的生化和免疫特征，所以AFP阳性率患者极易与其他肿瘤、慢性肝病或妊娠发生升高重叠现象，故寻找特异性强并具有互补诊断意义的检测手段而显得更为重要。Marrero等［6］认为 GP73在肝癌中的表达显著高于正常组织，且诊断早期肝癌的敏感性高于AFP，其采用WB方法检测144例肝癌、121例肝硬化患者血清，结果肝癌比肝硬化的血清GP73水平显著升高(P＜0.01)。本组资料显示PHC组GP73明显高于正常对照组(P＜0.01)。原发性肝癌血清AFU升高，可能与肝细胞合成AFU增加，并大量释放入血，同时AFU降解减慢以及含岩藻糖苷酶和代谢紊乱有关［7］。本组资料显示PHC组AFU明显高于正常对照组(P＜0.01)。血清Fer在肝脏合成且含量最多，当肝脏发生疾病或肿瘤时，肝细胞受损或破坏，就会释放大量Fer，本组资料中PHC患者的Fer明显增高，Fer的阳性率为 68.8%。

综上所述，血清肿瘤标志物对PHC的诊断均缺乏高度特异性，具有广谱性，单项检测阳性率不高，易弃漏阳性病人，而四项肿瘤标志物联合检测阳性率达98.8%。因此，AFP、AFU、Fer和 GP73 联合同步检测可互为补充，互为印证，从而提高原发性肝癌的诊断率。

［1］马桂英，刘 娟，姚红昌，等.多种肿瘤标志物对原发性肝癌的诊断价值［J］.临床内科杂志，2001，18(2):147-149.

［2］王 洋，余 宪，张 旭，等.AFP、AFU、GGT、ALP联合检测对原发性肝癌的诊断价值［J］.实用肿瘤学杂志，2003，10(1):23-24.

［3］Kladney KD，Bulla GA，Guo L，et al.GP73，a novel Golgilocalized protein upregulated by viral infegtion［J］.Gene，2000，249:53-65.

［4］Wright LM，Huster D，Lutsenko S，et al.Hepatocyte GP73 expression in Wilson disease［J］.J Hepatol，2009，51:557-564.

［5］潘 源，梁 寒.AFU、AFP及CEA对原发性肝癌的诊断意义［J］.中国肿瘤临床，2002，29:444-445.

［6］Marrero JA，Romano PR，Nikolaeva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatol，2005，43:1007-1012.

［7］汤钊猷.原发性肝癌［M］.第3版.上海:上海科学技术出版社，1992:29.