刘志鹏,王宗华,梁光萍,熊晓峰,范亚川,邹利全,王洪斌,陈 陵,李学成△

(1.中国人民解放军第三二四医院消化内科,重庆400020;2.第三军医大学护理学院,重庆400038;3.第三军医大学西南医院烧伤研究所,重庆400038)

端粒酶通过延长染色体末端端粒,维持细胞永生化能力。而人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的限速成分,直接决定了端粒酶活性[1]。目前有关hTERT的调控机制尚未完全明确。有关hTERT表达调控的研究大多为转录水平的调节,未涉及转录后的调节。但是转录水平的调节因子众多,关系复杂,很难通过控制转录水平的调节有效控制hTERT的表达。转录后的调节主要涉及微RNAs(miRNA)。miRNA是最大的一类基因表达转录后调控因子,极微量的miRNA即可对靶蛋白的表达产生有效的调控作用。研究hTERT在转录后水平的调控,对理解肿瘤发生发展机制,以及基于miRNA的肿瘤诊断与治疗具有重要意义[2]。在前期工作中成功包装了负载miR-138的腺病毒[3],在本研究中,进一步研究基于腺病毒载体的miRNA表达调控效果,为基于miRNA的hTERT转录后调控机制的研究,以及基于hTERT调控相关miRNA的肿瘤诊断与治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 标准胎牛血清,高糖DM EM培养液、RPM I 1640培养液以及胰酶消化液(美国 HyClone公司);Trizol试剂(美国Invitrogen公司),焦碳酸二乙酯水(北京天根公司),逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR试剂盒(日本TAKARA公司);MPERTM蛋白提取试剂(美国 Pierce公司);蛋白酶抑制剂(美国Sigma公司);BCA蛋白定量试剂盒(上海申能博彩公司);转化有腺病毒E1区基因的包装细胞 HEK293,本室保存。负载有miR-138表达序列的复制缺陷型腺病毒(Ad-miR138),由本室构建并保存[3];负载有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因 LacZ的复制缺陷型腺病毒,由西南医院心内科唐兵博士惠赠。……