陈 洁，黄佩佩，宋 茹

（浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山 316004）

由于脂质氧化作用而导致食品品质劣变是食品工业和消费者最为关注的食品质量安全问题之一，虽然BHT、BHA、TBHQ等现有合成抗氧化剂可以有效阻止脂质氧化劣变，但是存在对人体健康有潜在危害的副作用[1]。所以寻找天然、安全的抗氧化剂替代合成抗氧化剂是目前研究最为活跃的领域之一。国内外学者曾报道一些食物源蛋白质，如：豆类蛋白、乳蛋白、鱼蛋白等，通过可控酶切的方式来制备抗氧化肽类物质[2-8]。直接利用益生菌发酵鱼肉蛋白制备抗氧化肽的研究还少见报道，益生菌发酵法制备抗氧化肽的生产成本远低于蛋白酶切法，因此更适合于大批量生产抗氧化肽。本实验所用益生菌分离自发酵豆制品，所以安全性高，以水产加工企业利用率不高的低值海产小杂鱼蛋白为发酵底物，通过研究发酵影响因素，可为枯草芽孢杆菌发酵鱼蛋白制备抗氧化肽工艺优化奠定基础，并为海产小杂鱼的深加工新应用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低值海水鱼：购于舟山市北门菜市场，-20℃冻藏备用；枯草芽孢杆菌：分离自发酵豆制品。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自Sigma公司；蛋白胨、琼脂粉购自杭州天和微生物试剂有限公司；酵母浸膏购自中国医药集团上海化学试剂有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

高速组织捣碎机（DS-1型，上海标本模型厂）；恒温恒湿培养箱（HWS-270，宁波东北仪器有限公司）；水浴恒温振荡器（SHY-3型，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；精密pH计（pHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司）；低速离心机（DL-5型，上海安亭科学仪器厂）；分光光度计（722型，上海精密科学仪器有限公司）；立式电热压力蒸汽灭菌器（LD2X-40BI型，上海申安医疗器械厂）。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

用接种环取1～2环保存于固体斜面培养基的食用级枯草芽孢杆菌，接种到LB液体培养基中（酵母浸膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水 1 000 mL，调节 pH 7.0），37 ℃下 150 r/min 振荡培养 24 h，得活化菌悬液，备用。

1.3.2 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定

分别准确吸取1.0 mL活化菌悬液（107CFU/mL）于已装50 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，在转速150 r/min，37℃下恒温振荡培养。每隔4 h取出2.0 mL培养液于试管中，以不含菌LB液体培养基调零管，测定不同培养时间下570 nm处吸光值（OD570nm）。浓度大的发酵液用LB液体培养基稀释适当倍数，使吸光值在0.10～1.00，将稀释液对应的吸光值乘以相应稀释倍数，换算成原发酵液吸光值，以培养时间为横坐标，570 nm处吸光值纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线。

1.3.3 鱼糜制备

冻藏鱼体流动水解冻，切割成块，组织捣碎机捣碎成糜状，加入一定量蒸馏水和葡萄糖，自然pH（7.0左右），121℃灭菌30 min，得灭菌鱼肉蛋白培养基，备用。

1.3.4 发酵液定性检测

蛋白质、肽和氨基酸的定性检测分别用Bradford法、双缩脲法和茚三酮法[9-10]。

1.3.5 发酵液抗氧化性测定

以DPPH自由基清除率来衡量发酵液的抗氧化能力，DPPH测定参照文献[11]进行。1.0 mL样品与1.0 mL无水乙醇溶液混合，加入250 μL浓度为0.02%DPPH乙醇溶液，剧烈混合均匀，室温暗处放置60 min，经8 000 r/min离心10 min，取上清液用于测定；等体积蒸馏水代替样品，其余条件相同作为对照；等体积乙醇代替等体积0.02%DPPH为样品空白。以无水乙醇调零，分别测定样品、对照、样品空白在517 nm处吸光值，按照下面公式计算DPPH自由基清除率：

1.3.6 发酵影响因素研究

3.5 SpO2的高低与意识状态改变之间有着密切的联系 检测并提高SpO2对于降低非计划性拔管有着积极的意义，保持SpO2≥95%是降低患者出现意识状态改变的可靠手段之一。表1显示，在意识模糊评估提示出现意识状态改变时，同时也出现了SpO2≤95%的情况。证实了任艳萍等［10］提出的加强SpO2监测是早期发现缺氧及谵妄的简单有效的手段。

生物发酵过程中，接种量、发酵时间、底物浓度、装液量、摇床转速、发酵温度等均会影响到目标产物生成。以鱼肉蛋白为发酵底物可以提供枯草芽孢杆菌生长繁殖所需N源营养，在前期实验中发现单纯以鱼肉蛋白为底物，不利于枯草芽孢杆菌分解鱼肉蛋白释放出抗氧化片段，所以实验在鱼肉蛋白中加入适量葡萄糖以补充C源。在发酵温度固定（37℃）条件下，实验考察了接种量、发酵时间、水与鱼肉比例（相当于底物浓度）、葡萄糖添加量、装液量和摇床转速对产物抗氧化能力影响。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线的绘制

典型的微生物生长曲线包括生长适应期、对数生长期、稳定期和衰亡期4个阶段，由图1可以看出，枯草芽孢杆菌在0～4 h时处于生长适应期，4～20 h是快速生长对数期，20～72 h处于稳定生长期，培养时间大于72 h后，菌体开始衰老死亡。根据枯草芽孢杆菌生长曲线，选择菌种活化20～24 h生长旺盛的菌悬液用于鱼肉发酵液制备。

2.2 接种量对发酵产物抗氧化性影响

在相同发酵条件下，分别测定接种量为2%、3%、5%、8%、10%时，发酵产物的抗氧化能力，结果如图2所示。

由图2可知接种量在2%～5%时，发酵液抗氧化能力比较接近，其中2%接种量时发酵液对DPPH清除率为90.14%，当接种量大于5%后，发酵液对DPPH清除率低至88.60%，说明接种量过大不利于发酵产物中抗氧化性组分的生成。发酵液经茚三酮显色反应呈阳性说明含有游离氨基酸；双缩脲反应呈阳性表明含有蛋白质或肽类；Bradford显色为阳性说明含有蛋白质或肽类，综合上述检测结果可以判定枯草芽孢杆菌发酵鱼蛋白所得发酵液应为肽类混合物。在生物发酵中，接种量加大可以缩短菌体的延迟期，快速到达对数生长期和稳定期，有利于菌体的生长繁殖，但是在固定发酵时间条件下（实验中发酵时间为24 h），枯草芽孢杆菌在代谢过程中产生的蛋白水解酶可以酶解鱼肉蛋白质生成抗氧化型肽类，同时生成的抗氧化肽片断也有可能被继续水解成活性更强或活性降低的小肽段，当抗氧化型肽的生成量小于抗氧化肽降解为低活性肽时，发酵液的总体抗氧化性就会降低。

2.3 发酵时间对抗氧化性影响

枯草芽孢杆菌在培养时间20～72 h处于稳定生长期，菌体生成量稳定，以鱼肉蛋白为营养物质用于菌体生长繁殖时，发酵时间对发酵液抗氧化性影响如图3所示。

2.4 鱼肉培养基料液比对发酵液抗氧化性影响

图1 食用枯草芽孢杆菌生长曲线Fig.1 The growth curve of Bacillus subtilis derived from food

图2 接种量对发酵液抗氧化性影响Fig.2 Effect of inoculation content on the antioxidant activity of fermentation

图3 发酵时间对发酵液抗氧化性影响Fig.3 Effect of time on the antioxidant activity of fermentation

鱼肉蛋白发酵中，水和鱼糜的比例实际上影响了鱼肉蛋白作为发酵底物时的浓度，在2%接种量、葡萄糖添加量1%、50 mL装液量、150 r/min摇床转速、发酵时间24 h条件下，研究不同水：鱼糜比对发酵产物抗氧化性影响，结果如图4所示。

图4显示水：鱼肉比值大于3后，发酵产物的DPPH自由基清除率明显降低，其中水：鱼肉比为4时，DPPH清除率只有61.30%，而水：鱼肉比为1时DPPH清除率在90.00%以上。水量加大相当于对鱼肉蛋白起到了稀释作用，发酵底物浓度降低，不利于菌体的生长繁殖，结果蛋白酶类分泌少，造成蛋白发酵产物中抗氧化肽组成减少。

2.5 葡萄糖添加量对发酵液抗氧化性影响

在发酵过程中添加适量的葡萄糖可以提供菌体生长所需C源，有利于菌体生长繁殖，分泌大量水解酶类，促使蛋白降解释放更多抗氧化肽类。实验在2%接种量、水：鱼肉比为2、装液量50 mL、摇床转速150 r/min条件下，分别考察葡萄糖添加量为1.0%、1.5%、2.0%、3.0%时，发酵时间为24 h的鱼肉蛋白发酵液的抗氧化性，结果如图5所示。

图5显示在鱼肉培养基中加入一定量葡萄糖可以促进发酵产物抗氧化能力提高，葡萄糖添加量为2%时，发酵液DPPH自由基清除率达到91.43%，当葡萄糖添加量3%时，所得发酵液DPPH自由基清除率有所降低。鱼肉蛋白和一定量葡萄糖在中性pH 7.0下，高温121℃加热30 min灭菌处理后，鱼肉培养基颜色略变深，在该条件下极有可能发生羰氨缩合的美拉德热反应，而美拉德反应产物通常是大分子化合物并具有较强抗氧化能力。在鱼肉培养基中加入葡萄糖后，究竟是美拉德反应导致发酵液抗氧化能力提高？还是葡萄糖加入后，由于枯草芽孢杆菌的发酵作用提高发酵液的抗氧化能力？实验分别测定了鱼肉培养基不加葡萄糖和添加1%葡萄糖，其余发酵条件相同情况时发酵产物的DPPH自由基清除率，同时也测定了鱼肉培养基添加等量葡萄糖，但未发酵时样品的DPPH自由基清除率。结果证实在鱼肉培养基中仅添加葡萄糖的不发酵样品，DPPH自由基清除率要高于单纯的鱼肉发酵液，而在鱼肉培养基中添加葡萄糖，并且经过枯草芽孢杆菌发酵，结果发酵液的DPPH清除率是3种处理方法中最高的（具体数据未列出），表明葡萄糖的加入不仅可以促使美拉德反应产生，而且有助于枯草芽孢杆菌发酵鱼肉蛋白生成抗氧化性更强的发酵液。

2.6 装液量对发酵液抗氧化性的影响

在接种量2%、水：鱼肉比为2、葡萄糖添加量2%条件下，在250 mL的三角瓶中分别装入25 mL、50 mL、75 mL、100 mL的鱼肉培养基，固定摇床转速150 r/min，测定24 h发酵液的抗氧化性，结果如图6所示。

在生物发酵中，装液量的多少影响到发酵罐（或瓶）的溶氧量，而溶氧量将影响到菌体的生长繁殖。由图6结果可知装液量过少，如25 mL时，营养基质上方氧气充足，菌体可快速生长繁殖到达稳定期，释放出的蛋白酶水解鱼肉蛋白成肽段，低分量肽类吸收利用性要好于蛋白质和氨基酸，而具有抗氧化作用肽类大多相对分子量在3 000以下[12]。所以，在溶氧充足条件下，生长旺盛的菌体可能会利用已生成的抗氧化肽类作为营养基质用于自身生长繁殖，并且菌体分泌充足的水解酶也极有可能进一步酶切抗氧化肽段为抗氧化活性低或者无活性的肽类片段。图6结果显示当装液量在50～100 mL时，发酵液DPPH自由基清除率较高。

图4 水：鱼肉比对发酵液抗氧化性影响Fig.4 Effect of the ratio of water to fish meat on the antioxidant activity of fermentation

图5 加糖量对发酵液抗氧化性影响Fig.5 Effect of sugar content on the antioxidant activity of fermentation

图6 装液量对发酵液抗氧化性影响Fig.6 Effect of loading volume on the antioxidant activity of fermentation

2.7 转速对抗氧化性的影响

在接种量为2%、水：鱼肉比为2、葡萄糖添加量2%、装液量为50 mL时，研究不同摇床转速120 r/min、150 r/min和180 r/min下，鱼肉蛋白发酵24 h后的抗氧化性，结果如图7所示。

从图7可以看出在150 r/min下，发酵产物的DPPH自由基清除率最高，转速过低或过高均不利于鱼肉蛋白降解为抗氧化肽类。适当提高转速有利于氧气和菌体在培养液中均匀分布，便于鱼肉蛋白的吸收和代谢物的及时分散。但转速过高，过大的剪切力对菌体细胞可能造成损伤，结果菌体生长繁殖量减少，造成所分泌的蛋白酶减少。另外，转速过大也不利于蛋白酶与底物蛋白特定酶切位点接触，结果发酵液中水解得到的抗氧化组分含量降低。

图7 摇床转速对发酵液抗氧化性影响Fig.7 Effect of rotation speed on the antioxidant activity of fermentation

3 结论

利用食用级枯草芽孢杆菌发酵鱼肉蛋白制备抗氧化型发酵液，其中接种量、发酵时间、料液比、葡萄糖添加量、装液量、摇床转速对发酵产物的抗氧化性有影响。发酵液经蛋白质、肽类、游离氨基酸定性检测均呈阳性，说明枯草芽孢杆菌发酵鱼蛋白所得抗氧化型发酵液属于肽类混合物。有关发酵工艺的优化，发酵产物中有效抗氧化组分的分离及鉴定工作正在进行中。

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