沈璐璐，邓尚贵，赵传举

（1.浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山 316004；2.浙江味海食品配料有限公司，温州瑞安 325207）

酶具有专一性强、作用条件温和以及催化率高等特点，酶解技术在现代医药和食品领域的广泛应用都是基于酶的这些特性。酶解技术能使特定的酶在特定条件下达到最佳酶解效果，相较于其他方法如传统蒸煮法、微波法等，酶解法对原料的营养成分和小分子氨基酸具有更高的获取率[1]。张祥刚等[2]对内源酶酶解南美白对虾虾头和虾壳进行了研究，姜震等[3]为了提取龙虾废弃物中的蛋白质也使用了酶解技术。

我国虾资源丰富，虾类在加工过程中会产生数以万吨计的虾头、虾皮、虾尾等副产物，受技术水平的限制，这些副产物多用于生产低值饲料或是排放到环境中。虾副产物中营养丰富，含有大量的蛋白质、氨基酸、矿物质、虾青素、几丁质以及DHA、EPA和具有降压作用的多肽[4-5]，如何科学有效地提高虾副产物的利用率是资源优化利用的研究热点。本研究以虾副产物为原材料，利用生物酶解技术，获取具有高附加值的酶解液。反应制得的酶解液通过美拉德反应或是参与复合调配，还能生产出不同形态的应用型产品，如虾膏、虾粉等，这些产品又能辐射到方便食品、休闲食品等行列，具有极大的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

原料于2010年5月购自舟山市某一农贸市场，主要虾类为对虾，经处理取其虾头、虾尾和虾壳等副产物备用。

1.1.2 试剂

木瓜蛋白酶(80万U/g)、风味酶(20万U/g)、动物蛋白水解酶(60万U/g)、中性蛋白酶(20万U/g)均购自广西南宁庞博生物工程有限公司；胰酶(4 000U/g)购自南宁东恒华道生物科学技术有限责任公司；硫酸钾、硫酸铜、氢氧化钠、乙醚、盐酸(37%分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；甲醛(36%分析纯)购自宜兴市第二化学试剂厂。

1.1.3 主要仪器与设备

鲨鱼SXC12型绞肉机(上海强正机电有限公司)；85-2恒温磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)；SX2-4-10高温箱形电炉(上海博讯实业有限公司)；CU420电热恒温水箱(上海益恒实验仪器有限公司)；立式万用电炉(上海慧泰仪器有限公司)；DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；KDN-04C数控消化炉(上海新嘉电子有限公司)；JZQ-Ⅱ型均质器(天津市东康科技仪器技术开发中心)；PHS-3C型pH计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

原材料→搅碎打浆→蒸煮升温→恒温酶解→升温灭酶→残渣过滤→均质。

具体步骤：将购于市场的虾副产物经过处理，整理洗净，放置通风处沥干，再将其放入75℃的干燥箱中1.5 h，用绞肉机搅碎成浆状备用；取备用物料20 g，加入5倍水，以NaoOH调pH至7.0；置于恒温磁力搅拌器上升温至55℃，加入中性蛋白酶恒温作用1 h，再将温度降至50℃，加入风味蛋白酶恒温作用3 h；再升温至95℃保持15 min灭酶；将酶解产物用筛网过滤取得酶解液，通过均质器均质即可。

1.2.2 化学成分测定方法

水分测定采用常压直接干燥法[6]；灰分测定采用灼烧重量测定法[6]；总蛋白测定采用凯氏定氮法[6]；粗脂肪测定采用索氏抽提法[6]；氨基酸态氮及水解度测定采用甲醛电位滴定法[7]。水解度DH为酶解液中氨基态氮与样品中总氮的比值。

1.2.3 感官评定法

感官评定是用来测量感官的感知以及这种感知对食物和口味接受性的影响，本实验在对酶解温度的确定上使用了该方法，由4位经验丰富的业内人士评定获得，评分标准见表1。

2 结果与讨论

表1 感官评定表Tab.1 Sense value

2.1 虾副产物主要成分分析

虾副产物中具有不亚于虾肉本身的营养，其主要成分为水分、灰分、总氮以及粗脂肪[8]。对4种成分的测定分别设计了6组平行实验，实验结果见表2。水分测定分2步，自然风干时水分较多，占总水分的80%左右，风干效果较明显。常压干燥时，由于物料表面已干燥，形成一层阻挡内部水分继续蒸发的“保护膜”，水分减少的速度明显减慢，水分蒸发效果并不明显；灰分测定的结果以干基计，即在除去水分的基础上计算的灰分含量，在冷却和测量过程中保持灰化物料处于干燥条件下，避免回吸空气水分，减小误差。

2.2 酶解最适条件的确定

2.2.1 酶制剂的确定

影响虾副产物酶解程度的因素很多，包括酶制剂的选择、酶用量、固液比、酶解温度、酶解时间和pH。制定酶解工艺的第一步是要选择最适合的酶制剂，参考表3可以初步确定。

各种蛋白酶作用于虾副产物后，能产生更利于人体吸收的氨基酸和多肽，风味蛋白酶则能将原有酶解底物继续催化，使其风味更加浓郁[11]。以表3中酶制剂最适条件为依据，分别使用足量等量的中性蛋白酶、胰酶、动物蛋白水解酶和木瓜蛋白酶对虾副产物进行酶解，再加入等量风味蛋白酶进行风味提升。在此条件下酶解液感官评定结果见表4，水解度结果如图1所示。由表4可知不同酶制剂作用下酶解液呈味结果的优劣顺序为2、4、1、3。图1显示水解度最高为14.11，故最佳酶制剂为中性蛋白酶与风味酶的组合。

2.2.2 酶用量的确定

各酶制剂适宜的加酶量各不相同，中性蛋白酶和风味蛋白酶加酶量控制在1%左右[10,12]。按L8(42)设计正交试验，并对氨基态氮进行方差分析，结果见表5和表6。方差分析可知，F值为14.88，查F值表得F0.05（3,4）=6.59,14.88＞6.59,P＜0.05，F值和P值可以反映变量的重要性，F值越大，P值越小显著性越大[13]。加酶量对虾副产物酶解程度有显著性影响，结合酶解液的呈味结果，确定最佳酶用量为中性蛋白酶1 000 U/g，风味蛋白酶1 000 U/g。

2.2.3 固液比的确定

表2 虾副产物主要成分分析Tab.2 Analysis of main components on by-products of shrimp

表3 各种蛋白酶的特性[9-10]Tab.3 Characteristics of different proteinase

表4 酶解液感官评定结果Tab.4 Results of enzymolysis liquid′s sensory evaluation

图1 不同酶制剂下的水解度Fig.1 Hydrolysis degree on different enzyme

表5 酶用量对酶解液风味和氨基态氮含量的影响Tab.5 Effect of enzyme amount on enzymolysis liquid′s flavour and amino-acid nitrogen content

固液比对酶解程度也有较大影响，一定液体的混入，既有利于酶解底物在反应过程中均匀受热，也有利于酶制剂的分散，提升反应速度，提高产物酶解率，而过量的水分则会使酶制剂浓度处于较低水平，不利于酶解的进行[14]。改变固液比，测得氨基态氮的结果如图2所示。随着固液比的下降，酶解液中氨基态氮含量不断升高，达到1:5后氨基态氮含量增加趋于水平，直至下降。受制于实验条件，确定1:5为最佳固液比。

2.2.4 酶解温度的确定

温度对酶解率的影响颇为重要，温度太低会使酶活性受到抑制，而温度过高会使酶失活[15]，两者都能造成酶解率下降。根据表3在40～60℃范围内改变酶解温度，采用正交法和感官评定法确定最佳酶解温度，在所设计的正交试验下测得的氨基态氮含量如图3所示，根据表1的感官评定标准，评定结果见表7。结合表7和图3可知，风味佳酶解效率高的温度组合为10，即中性蛋白酶温度55℃，风味蛋白酶温度50℃为最佳酶解温度。

表6 氨基态氮方差分析表Tab.6 ANOVA Value on amino-acid nitrogen

图2 固液比对氨基态氮含量的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on amino-acid nitrogen content

表7 温度对酶解液风味的影响Tab.7 Effect of temperature on enzymolysis liquid's flavour

2.2.5 酶解时间的确定

时间也是影响酶解率的一个重要因素，充分的酶解时间，可以使蛋白质转化为氨基酸和短肽的概率达到最大。作用时间过长会使酶解液呈现明显的苦味，这是由于在肽末端存在一些疏水性氨基酸这些氨基酸会随着酶作用时间过长从肽上脱离，中性蛋白酶和风味蛋白酶都具有内肽酶的本质特点即对疏水性或碱性残基的C末端多肽结合特异性较差，更加增加了苦肽酶产生的可能[16]。所以应合理控制酶解时间避免呈味不佳。在单因素实验的基础上，设计中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解时间的正交实验，实验结果见表8，对氨基态氮的方差分析见表9。结合表9结果查F值表得到F0.05（1,4）=7.71＜33.11，P＜0.05，故组间和组内的差异性明显，不同时间对酶解率有显著性意义。由表8可知保证酶解液风味佳的前提下，组合5具有最佳酶解率，故确定酶1作用时间为1 h，酶2作用时间为3 h，综合酶解时间4 h为最佳酶解时间。

2.2.6 pH的确定

图3 不同温度组合下的氨基态氮Fig.3 Amino-acid nitrogen content on different temperature combination

pH可以影响底物与酶制剂的解离程度，过小或过大的pH都会使酶制剂失活，只有在最适的pH下，才能使酶制剂具有最佳催化作用[17]。根据表2将pH控制在6～8范围内，为了保证实验的连续性，2种酶制剂在相同的pH条件下进行酶解。结果如图4所示。由图4可知，氨基态氮含量随pH条件的变化明显，最佳pH为7.0。这是由于所用酶制剂中的中性蛋白酶是一种对pH要求较高的酶类，故在最适点能得到最大的酶解效果。

3 结论

虾类副产物中各主要成分含量，除了水分占绝大多数外，灰分含量为14.36%，蛋白质含量为12.48%，粗脂肪含量为2.59%。该结果可以为人们更精确地了解其组成成分、提取并分离其营养物质提供可靠的依据。综合各因素最佳条件对虾副产物进行最终酶解，得到的酶解液风味浓郁醇厚，氨基态氮含量高于各个分段实验，结果得到有效验证。最终确定的最适条件为：酶制剂为中性蛋白酶与风味酶的复合；中性蛋白酶最适酶用量为1 000 U/g、最佳酶解温度55℃、酶解时间为1 h；风味蛋白酶最适酶用量为1 000 U/g、最佳酶解温度为50℃、酶解时间为3 h；整个实验过程最适pH为7.0，最适固液比为1:5。

表8 时间对酶解液风味和氨基态氮含量的影响Tab.8 Effect of time on enzymolysis liquid's flavour and amino-acid nitrogen content

表9 氨基态氮方差分析表Tab.9 ANOVA on amino-acid nitrogen

图4 pH对酶解液氨基态氮含量的影响Fig.4 Effect of pH on amino-acid nitrogen content

[1]杨铭铎,沈春燕,张根生.猪骨水解液营养成分分析研究[J].食品科学,2009,30(14):272-275.

[2]张祥刚,周爱梅,陈毅雯.内源性蛋白酶酶解南美白对虾虾头、虾壳的研究[J].食品科技,2010,35(3):134-141.

[3]姜 震,余顺火,王 荣,等.酶法提取龙虾废弃物中蛋白质的工艺研究[J].现代食品科技,2009,25(2):185-187.

[4]付雪艳,薛长湖,宁 岩,等.中国毛虾酶解多肽降压作用的初步探讨[J].海洋科学,2005,29(3):20-24.

[5]章超桦,曹文红,吉宏武,等.中国毛虾ACE抑制肽的初步研究[J].水产学报,2005,29(1):97-102.

[6]黄伟坤.食品检验与分析[M].北京:轻工业出版社,1989.

[7]张意静.食品分析技术[M].北京:轻工业出版社,2001.

[8]邓尚贵,杨 平,庞艳生,等.虾头酱的研制[J].食品发酵工业,2002,28(10):80-83.

[9]BABU C M,CHAKRABARTI R,SAMBASIVARAO K R S.Enzymatic isolation of carotenoid-protein complex from shrimp head waste and its use as a source of carotenoids[J].LWT-Food Science and Technology,2008,41(2):227-235.

[10]隋 伟,张连富.酶解虾加工下脚料工艺的研究[J].中国调味品,2005(12):53-57.

[11]袁振远.风味酶[J].食品科学,1988(10):1-2.

[12]高允盛,方镇宏,曹小飞,等.添加限制性酶解豆乳制作模拟Nozzarella干酪优化工艺的研究[J].食品科技,2010,35(8):94-100.

[13]HORT J,GRYS G L.Developments in the textural and rheological properties of UK Cheddar cheese during ripening[J].International Dairy Journal,2001,11(7):475-481.

[14]CAO W H,ZHANG C H,HONG P Z,et al.Response surface methodology for autolysis parameters optimization of shrimp head and amino acids released during autolysis[J].Food Chemistry,2008,109(1):176-183.

[15]腾 瑜,乔向英,曲克明.牡蛎酶解工艺条件的研究[J].海洋水产研究,1997,18(1):112-116.

[16]高梅娟,刘 平,兰小红.双酶酶解豆粕蛋白制备低苦味肽[J].食品工业科技,2010,31(2):193-197.

[17]周顺伍.动物生物化学[M].北京:中国农业出版社,2002.