焦淑洁 许慧芳 张苏明 许 杰 湛延强

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科 武汉 430030 2）郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

研究表明丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号转导途径在中枢神经系统广泛表达，各种细胞外刺激信号，均可通过这一通路影响突触传递，神经元的重塑、形态分化和生存等。目前已发现哺乳动物脑组织细胞至少有4种严格调节的MAPK，其中发挥主要作用的为p38α，参与多种细胞的调控增殖。本实验前期发现在体外VEGF能够促进人胚胎干细胞神经分化［1］，给予p38 MAPK信号通路抑制剂，检测细胞内p38αmRNA的变化，以观察MAPK信号转导通路是否在VEGF促神经细胞生长和分化中发挥作用，从而进一步了解VEGF在体外hESCs神经分化中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 人胚胎干细胞及相关培养基 人胚胎干细胞系TJMU1和TJMU2，由本实验室与同济医院生殖中心前期研究人员建系［2］，本实验室保存。诱导分化相关培养基：（1）hESCs培养基：KNOCKOUT DMEM（Gibco）、血清替代物（Gibco）、L－谷胺酰胺（Hyclone）、非必需氨基酸（Hyclone）、β－巯基乙醇（Sigma）、重组碱性成纤维细胞生长因子（basic－fibroblast growth factor，bFGF）（Sigma）及青链霉素（Hy－clone）。（2）拟胚体（Embryonic body，EB）培养基：hESCs培养基去除bFGF。（3）神经干细胞培养基：DMEM／F12（Hyclone）、B27（Gibco）、Noggin（R＆D）、bFGF、非必需氨基酸、L－谷胺酰胺及青链霉素。（4）神经元培养基：DMEM／F12、ITS（Sigma）、N2（Gibco）、脑源性神经生长因子（R＆D）、表皮生长因子（R＆D）、B27、L－谷胺酰胺、非必需氨基酸及青链霉素。

1.2 其他实验试剂 VEGF（Peprotech）；p38MAPK 抑制剂SB203580：Sigma；抗Nestin抗体（神经干细胞标志）；抗微管相关蛋白－2（anti－microtubule－associated protein 2，MAP－2，成熟神经元标志）多克隆抗体（Chemicon）；DAPI（Sigma）；FITC标记的荧光二抗（北京中杉金桥）；Trizol and RT－PCR试剂盒（Fermentas）。

1.3 hESCs培养、分化及实验分组 hESCs复苏后，接种于丝裂霉素灭活的胚胎鼠成纤维细胞饲养层上，加入hESCs培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，第6～7d机械法传代。……