李延红，周占业，史 齐，皇甫超申

(河南大学医学院环境医学研究所，河南开封 475004)

人体亚硝酸盐不仅是一氧化氮(nitric oxide，NO)代谢过程中的一种惰性产物［1］，而且在细胞信号传导以及维持内环境NO稳态中起重要的作用［2］。通常情况下，组织氧含量正常，体内NO由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)产生;但是在组织缺氧时，体内NO则来自于亚硝酸盐还原途径［3］。有实验证实低浓度的亚硝酸盐及其还原产生的NO共同通过抑制细胞线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生、减少氧的消费、激活NO/cGMP通路等一系列事件发挥细胞保护、血管再生、舒张血管的功能，从而拮抗缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)诱导的组织损伤［4］。低剂量亚硝酸钠不仅对细胞无明显毒害，而且对细胞增殖有促进作用［5］。乙醇对脑组织的损伤主要是通过ROS实现的，从理论上分析，用低浓度的亚硝酸盐预处理，神经元可以拮抗乙醇诱导的细胞凋亡。为此，本实验选用大鼠嗜铬细胞瘤细胞(rat pheochromoeytoma cells，PC12)［6］探讨亚硝酸盐对乙醇诱导的细胞过氧化损伤的拮抗作用，为科学评价亚硝酸盐药理作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器

1.1.1主要试剂PC12细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所。亚硝酸钠(NaNO2)，天津市晨福化学试剂厂(分析纯);DMEM培养基(Gibco，with high glucose);胎牛血清，杭州四季青生物公司产品;一氧化氮清除剂c-PTIO(2-(4-carboxyphenyl)-4，4，5，5-tetramathylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、Hoecheste 33258 和PI购自Sigma公司。FITC-AnnexinⅤ/PI细胞凋亡检测试剂盒购于美国Bender公司;可见光法测丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活力测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。兔抗Caspase-3、Caspase-9多克隆抗体，Bcl-2、Bax单克隆抗体(Santa Cruz生物技术公司)。β-actin抗体、兔抗 HIF-1α抗体、enhanced chemiluminescence(ECL)显色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-polymer goat anti-rabbit IgG)(碧云天公司)。

1.1.2主要仪器Multiskan MK3型酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)。FACS Salibur流式细胞仪(BD，美国);BX51荧光显微镜(OLYMPUS，日本);UV-540紫外-可见分光光度计(UNICAM，美国)。DYY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂)。WD-9413B凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂)。

1.2方法

1.2.1细胞培养PC12细胞培养于含体积分数为10%的灭活胎牛血清、青霉素(1×105IU·L－1)和链霉素(100 mg·L－1)的DMEM培养液中，培养温度为37℃，含5% 二氧化碳(CO2)的细胞培养箱，取对数生长期的细胞进行实验，以0.25% 胰蛋白酶消化传代，调整细胞数为1×107·L－1，备用。

1.2.2实验分组及处理预处理PC12细胞的亚硝酸钠浓度选用课题组前期MTT结果，即亚硝酸钠最低促PC12细胞增殖效应(高于对照组15%)浓度为 0.14 mmol·L－1，预处理时间为 24 h［7］。实验分4组:对照组加等量培养液;单纯乙醇处理组加400 mmol·L－1(IC50值)乙醇作用 2 h;预处理组先用0.14 mmol·L－1亚硝酸钠预处理 24 h，再加 400 mmol·L－1乙醇作用 2 h;NO 清除组用0.14 mmol·L－1亚硝酸钠和 40 μmol·L－1c-PTIO 共同预处理24 h，再加 400 mmol·L－1乙醇作用 2 h。

1.2.3MTT法检测细胞增殖活力取1×107·L－1PC12细胞接种到96孔细胞培养板(每孔0.2 ml)培养24 h后换液，按照实验分组经不同处理后，每孔加入20 μl MTT，4 h后，吸去培养液，每孔加入150 μl DMSO于振荡器上振摇，待蓝色晶体完全溶解后，在酶标仪上测定570 nm处的吸光度值(A值)并计算细胞活力。以含有等体积的培养液和DMSO的无细胞孔测得的A为空白对照。实验重复3次，结果取平均值。细胞活力/%=(处理组A值/对照组A值)×100%。

1.2.4Hoechst 33258/PI活细胞联染判定细胞生存状态将对数生长期细胞以1×107·L－1浓度接种于预置盖玻片的6孔培养板中，按实验分组处理后，倾去培养液，预冷PBS洗3次，特异结合DNA的荧光染料Hoechst 33258和PI进行活细胞联染。加Hoechst 33258 10 mg·L－1及 PI 10 mg·L－1，37℃染色15 min后，紫外光激发，荧光显微镜观察，电荷耦合器拍片。活细胞呈蓝色，凋亡细胞呈亮白色，坏死细胞呈红色。荧光显微镜下随机选择5个视野，每张爬片计数细胞不少于1 000个，实验重复3次，以凋亡细胞数与总细胞数比值的百分数表示细胞凋亡率。

1.2.5流式细胞术测定细胞凋亡采用FITC-AnnexinⅤ/PI双染法，分别收集各组细胞到10 ml的离心管中，每样本细胞数为1×109·L－1，1 000×g离心5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1次，1 000×g离心5 min，用100 μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15 min，1 000×g离心5 min，沉淀细胞用孵育缓冲液洗1次，加入FITC-AnnexinⅤ/PI溶液5 μl 4℃下孵育20 min，最后补PBS 400 μl，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每个样品检测1万个细胞，用Cellquest软件进行细胞凋亡分析。

1.2.6脂质过氧化产物与抗过氧化酶活力或含量的测定对数生长期细胞以1×107·L－1浓度接种于培养瓶中，培养至对数生长期，按实验分组处理后，收集细胞，按照试剂盒说明书，采用比色法测定细胞内SOD、CAT活力和GST-Px、MDA含量。实验重复3次，结果取平均值。

1.2.7Western blot检测相关蛋白表达细胞于对数生长期进行分组处理，作用24 h后用RIPA 200 μl充分裂解提取蛋白，考马斯亮蓝G-250法测样品蛋白浓度，均衡每组蛋白浓度后，以12%SDS-PAGE凝胶电泳分离。电转移蛋白至NC膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入各种一抗(1∶200)于4℃封闭袋中孵育过夜，二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，1∶4 000)孵育1 h。化学发光法显示结果，压片曝光。凝胶图像分析系统拍照，检测蛋白质印迹条带。

1.3 统计学分析数据均采用±s表示，应用SPSS 13.0软件包处理，进行直线相关分析，t检验，单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结果

2.1亚硝酸钠预处理对PC12细胞增殖活力的影响由Fig 1可见:单纯乙醇处理组细胞增殖活力与对照组相比明显下降(P＜0.05);预处理组细胞增殖活力与单纯乙醇作用组相比明显增加(P＜0.05);NO清除组细胞增殖活力与预处理组相比有所下降(P＜0.05)。

Fig 1 Cell viability in PC12 cells pretreated 0.14 mmol· L-1 NaNO2for 24 h，then exposed to ethanol for additional 2 h(±s，n=3)

2.2亚硝酸钠预处理对乙醇损伤PC12细胞生存状态的影响Fig 2所示，正常活细胞核呈蓝色，染色均一;坏死的细胞核肿大，呈红色;凋亡的细胞核固缩，染色质凝集，呈亮白色。对照组(Fig 2A)细胞生存状态良好，有少数细胞死亡，死亡率约(1.58±0.33)%;单纯乙醇处理组(Fig 2B)有大量细胞坏死和凋亡，两者占死亡细胞的比例基本相同，计数细胞死亡率为 (52.4±6.84)%，明显高于空白对照组(P＜0.05);预处理组(Fig 2C)坏死细胞明显减少，细胞死亡的主要形式是细胞凋亡 ，计数死亡率为(28.1±3.74)% ，与单纯用乙醇处理组相比 ，死亡率明显减少(P＜0.05)。NO清除组(Fig 2D)细胞凋亡率为(37.98±4.19)%，与预处理组相比凋亡和坏死细胞有所增加(P＜0.05，Fig 2E)。

Fig 2 0.14 mmol·L-1NaNO2preconditioning inhibited PC12 cells death induced by high dose ethanol(±s，n=3)

2.3亚硝酸钠预处理对乙醇损伤PC12细胞凋亡的拮抗作用流式细胞术检测结果如Fig 3，NaNO2预处理对乙醇损伤的PC12细胞凋亡拮抗的统计结果见Fig 3E。对照组(Fig 3A)有少量细胞凋亡;单纯乙醇处理组(Fig 3B)有大批细胞凋亡，与对照组相比差异有显著性(P＜0.05);预处理组(Fig 3C)细胞凋亡率与单纯用乙醇处理组相比明显减少(P＜0.05);NO清除组(Fig 3D)细胞凋亡率与预处理组相比有所增加(P＜0.05)。

Fig 3 Inhibition of ethanol-treated apoptosis of PC12 cell by NaNO2preconditioning(±s，n=3)

2.4亚硝酸钠预处理对乙醇损伤PC12细胞MDA含量和抗氧化酶活性的影响Tab 1所示，单纯乙醇处理组与对照组相比，细胞内 CAT、SOD活性GSH-Px含量明显降低，MDA含量升高(P＜0.05);预处理组与单纯乙醇处理组相比，细胞内CAT、SOD活性和GSH-Px含量明显升高(P＜0.05)，而MDA含量明显下降(P＜0.05)。NO清除组与预处理组相比，细胞内CAT、SOD活性和GSH-Px含量明显降低，MDA含量升高(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of NaNO2preconditioning on the contents of antioxidant enzyme and MDA in ethanol injury PC12 cells(±s，n=3)

Tab 1 Effect of NaNO2preconditioning on the contents of antioxidant enzyme and MDA in ethanol injury PC12 cells(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Ethanol group;△P＜0.05 vs NaNO2+Ethanol group

Group CAT/103U·g－1Pro T-SOD/103U·g－1Pro GSH-Px/mmol·g－1Pro MDA/mmol·g－1Pro Control 29.33 ±2.3 68.92 ±3.26 78.2 ±3.19 36.26 ±15.6 Ethanol 11.45 ±0.93* 20.95 ±1.68* 41.17 ±2.72* 98.38 ±11.5*NaNO2+Ethanol 19.29 ±0.27# 62.38 ±2.98# 62.59 ±1.41# 49.38 ±2.93#c-PTIO+NaNO2+Ethanol 15.98 ±1.9△ 40.23 ±1.57△ 51.21 ±1.52△ 73.58 ±14.7△

2.5亚硝酸钠预处理对乙醇诱导PC12细胞线粒体凋亡途径相关蛋白表达水平的影响Fig 4显示:单纯乙醇处理组与对照组相比，细胞促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3 表达增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达减少(P＜0.05);预处理组与单纯乙醇处理组相比，Bax、Caspase-9、Caspase-3表达量下降，而Bcl-2表达量增加(P＜0.05);NO清除组与预处理组相比，Bax、Caspase-9、Caspase-3表达量有所增加，而Bcl-2表达量有所减少(P＜0.05)。

Fig 4 The Caspase-9/Caspase-3 signal pathway involved in PC12 cells apoptosis induced by NaNO2preconditioning and then exposed to 400 mmol·L-1ethanol(±s，n=3)

2.6NaNO2预处理对乙醇损伤PC12细胞HIF-1α蛋白表达的影响Fig 5显示:乙醇处理组细胞HIF-1α表达量与对照组相比有所增加(P＜0.05);预处理组HIF-1α表达量较乙醇组相比明显增加(P＜0.05);NO清除组HIF-1α表达量较预处理组有所下降(P＜0.05)。

Fig 5 Expression of HIF-1α in PC12 cells induced by NaNO2preconditioning for 24 h then exposed to ethanol for 2 h(±s，n=3)

3 讨论

本课题MTT结果显示，先用0.14 mmol·L－1NaNO2预处理组，较单纯乙醇处理的PC12细胞的活力明显增加。流式细胞术结果显示，NaNO2预处理明显拮抗乙醇诱导的PC12细胞凋亡。荧光染色细胞核形态观察也佐证了上述现象。当培养体系内NO被清除后，上述低剂量NaNO2预处理对乙醇损伤PC12细胞的保护作用一定程度上被抑制。结果提示，亚硝酸盐及其还原的NO共同参与了乙醇损伤PC12细胞的保护作用。

NaNO2预处理对乙醇损伤PC12细胞保护作用可能与下列因素有关:①ROS产生减少:线粒体是ROS产生的主要场所，也是乙醇作用的靶点。乙醇经线粒体细胞色素P450代谢时，伴随产生大量的氧自由基(O－2、H2O2等)，引起脂质过氧化反应，通过线粒体途径启动细胞凋亡，导致细胞损伤［8］。亚硝酸盐或NO作用的靶点是线粒体呼吸链复合物I和IV，通过对靶点的抑制，减少乙醇处理时细胞ROS的产生［9］。②ROS清除增加:亚硝酸盐或其来源的NO提高了细胞抗氧化酶活性。实验结果显示，NaNO2预处理的细胞，当遇到乙醇处理时，细胞内CAT、SOD活性和GSH-Px含量明显升高，这样由乙醇处理细胞产生的ROS就会较多的被清除，从而减轻了乙醇对细胞的损伤。③抑制线粒体凋亡途径:亚硝酸盐还原为NO，NO与细胞色素C氧化酶相互作用，使细胞色素C释放减少，这样乙醇诱导的线粒体凋亡途径一定程度上被抑制，拮抗细胞凋亡，进而发挥细胞保护作用［10］。本课题通过对线粒体通路相关分子研究发现，NaNO2预处理，明显逆转乙醇导致的Bax、Caspase-9、Caspase-3升高和Bcl-2降低，NO特异性抑制剂c-PTIO可部分抑制这一现象。结果提示，亚硝酸盐及其还原的NO参与了乙醇诱导的细胞线粒体凋亡拮抗作用［11］。

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞适应缺氧而产生的一种核转录因子，通过上调糖转运和糖酵解酶的相关基因，使细胞在低氧或氧化应激时存活下来［12］，除缺氧外，其他如生长因子、激素、NO 等因子皆可导致HIF-1在细胞内积累［13］。本实验结果显示，低剂量NaNO2具有促进细胞HIF-1α累积的作用，这样亚硝酸盐预处理的细胞就有可能通过HIF-1途径发挥细胞保护作用［14］。

综上所述，亚硝酸钠通过提高PC12细胞抗氧化酶活性、促进HIF-1积累，进而使细胞获得了拮抗乙醇诱导的线粒体途径凋亡的能力。

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