张亚宏，甘 莹，郭子华，谢松强

(1.河南大学天然药物与免疫工程重点实验室，河南开封 475004;2.开封市中医院脑病科，河南开封 475000)

紫草素(shikonin)是从紫草科植物紫草的根中提取出的一种有效成分，其化学结构为萘醌类化合物，具有抗炎、抗肿瘤等作用［1－2］。文献报道可以诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，但是其凋亡机制还不甚明了［3－4］。ROS是生物体有氧代谢过程中产生的一类活性含氧化合物的总称，其在细胞凋亡中发挥着重要的作用［5－6］。本文选用人宫颈癌HeLa细胞为研究对象，研究shikonin对肿瘤细胞生长的抑制作用，并探讨其机制是否与ROS有关。

1 材料与方法

1.1药品与试剂紫草素(shikonin)购于中国药品生物制品检定所;应用时用二甲基亚砜(DMSO)溶解，并使DMSO的终浓度低于0.01 g·L－1。甲基噻唑蓝(MTT)、DMSO、碘化丙啶 (PI)和RNase A均购于美国 Sigma公司;p38MAPK 抑制剂(SB203580)购于美国Calbiochem公司。caspase-3、p-p38及β-actin的单克隆抗体及辣根过氧化酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗购于Santa Cruz Biotechnology公司。RPMI 1640培养基(Gibco，USA)，胎牛血清为北京元亨圣马生物试剂公司产品。

1.2细胞培养人宫颈癌HeLa细胞购自美国A-merican Type Culture Collection(ATCC)。细胞单层接种在含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3细胞生长抑制实验取对数生长期的HeLa细胞，以每孔1.5×104个细胞埋入96孔板。培养24 h后，加入不同浓度的shikonin;或在加入不同浓度抑制剂 1 h 后，加入35 μmol·L－1的 shikonin。每组设置3个复孔，同时设置阴性对照。置于培养箱中继续培养至不同时间点，每孔加入5 g·L－1MTT 10 μl再培养3 h后，吸弃上清液，每孔加入 150 μl DMSO溶解，于酶标仪492 nm下测定各孔吸光值(A值)，根据以下公式计算抑制率:

1.4细胞形态学观察以每孔5×105个细胞的密度接种于6孔板中，培养24 h后加入浓度为0和35 μmol·L－1的 shikonin，用倒置显微镜观察细胞形态并拍照。……