冯玉奎，郑长青，孙英姿，高 波

乳酸杆菌（Lactobacillus）是在乳酸菌中与动物关系最密切的菌属，动物和人类从口腔到直肠始终有该菌存在，是动物肠道中占优势的菌群之一。当动物消化道中乳酸杆菌的比率下降，则动物消化机能紊乱，严重者导致动物肠炎、下痢等疾病。乳酸杆菌的数量变化往往预示着人身体状态发生变化。因此确切了解乳酸杆菌变化及对乳酸杆菌进行精确定量对疾病的诊断有着重要的意义[1-4]。

本研究依据乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物，以常规PCR产物经克隆后的质粒DNA为标准品，经光谱定量、梯度稀释后制备标准曲线。抽提肠道菌群的细菌基因组DNA，用实时荧光定量PCR技术定量分析样品中乳酸杆菌数量。

该项目完成后，有望建立一种高灵敏度的乳酸杆菌及肠道菌群定量检测体系，该检测体系将为定量检测乳酸杆菌提供有效的实验手段，并为相关检测试剂的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 检测样品 40份成年健康人粪便。用无菌离心管收集其粪便标本，置在-20℃冰箱保存备检。

1.1.2 工具酶和试剂 Genomic DNA purification kit、Gel and PCR clean-up system、质粒小量纯化试剂盒购自购自Promega公司；RealMasterMix(SYBR Green)为北京天根公司产品；pMD18simple-T vector、ExTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL2000等购自日本TAKARA生物工程公司；MRS培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.1.3 仪器 本研究中所用的定量PCR仪为美国应用生物系统公司ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪。

1.2 乳酸杆菌的传统活菌计数 乳酸杆菌的活菌计数依标准方法精确取0.1 g粪便利用MRS培养基培养计数，其详细步骤见文献[5]。

1.3 FQ-PCR引物的设计 利用DNAMAN引物设计软件设计扩增乳酸杆菌的引物。……