郭丽 ，杨焕民 ，于志国 ，计红 ，符亚原

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319;2.黑龙江省大庆石油管理局农场）

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

大肠杆菌工程菌 DH5α、BL21（DE3）由黑龙江八一农垦大学动物科技学院分子生物学试验室保存。pMD18-T载体质粒购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 主要仪器及试剂

DNA回收试剂盒（上海华舜生物工程有限公司/上海华尧核酸技术有限公司）

质粒快速提取试剂盒（上海华舜生物工程有限公司/上海华尧核酸技术有限公司）

1.1.3 动物及采样

产蛋期籽鹅5只，处死后立即采集脑垂体，液氮冷冻后，置于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取

取籽鹅脑垂体一枚（约40 mg），用Trizol法提取总RNA，并置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 RT-PCR

在 1.5mL EP 管中加入 Oligo（dT）153.0 μL，总RNA 5.0 μL，dNTP（各 10 mmoL·L-1）1.0 μL，无 RNA酶水4.0 μL；然后置于65℃水浴5min，冰浴不少于1min；再加入 5×buffer 4.0 μL，DTT （0.1 moL·L-1）1.0 μL，Reverse Transcriptase Ⅲ 1.0 μL （200 U），Rnase Inhibation 1.0 μL；50 ℃水浴 30～60min，再进行70℃水浴15min，灭活Reverse TranscriptaseⅢ。

1.2.3 PRL基因的钓取

根据NCBI发布的皖西白鹅乳素基因编码区序列（GenBank登录号：DQ062571），用Primer Premir 5.0设计出一对引物：

上游引物：5′-ATGGATCCATGAGCACCAAGGG GGCTTC-3′;

下游引物：5′-CCGAAGCTTTTAGCAATTGCTAT CATGTATTAG-3′。

划线部分为BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

25μL PCR扩增体系中分别加入无RNA酶水13.35 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+20 mmoL·L-1）2.5 μL，dNTP（各 2.5 mmoL·L-1）2.0 μL，Upper Primer 1.0 μL，Lower Primer 1.0 μL，模板 cDNA 5.0 μL，LA Taq 酶0.15 μL。扩增程序为：94 ℃ 5min，94 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72℃ 1min，进行35个循环；72℃ 5min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳。并用试剂盒纯化回收PCR产物。

1.2.4 PRL基因克隆载体与原核表达载体的构建

将纯化回收的PCR产物与pMD18-T载体重组，转化入BL21（DE3）感受态细胞中。用质粒快速提取试剂盒抽提纯化，经PCR和双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，将阳性鉴定的菌液送至上海Invitrogen生物有限公司（北京分部）测序。所得质粒命名为pMD18-T-PRL。

将测序正确的克隆重组质粒用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，释放催乳素片段，与同样用BamHⅠ和HindⅢ酶切的表达载体pET-32 a（+）质粒重组，转化入DH5α感受态细胞中，经PCR及酶切鉴定正确的即为籽鹅表达质粒pET-32a（+）-PRL。……