赵建宝 陈 琛

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系统常见的恶性肿瘤,迄今仍为不可治愈性疾病,高发于老年人。美国癌症协会2009年统计显示,MM中位发病年龄男性62岁,女性61岁。血管新生与MM发生、发展密切相关，而调控血管新生的众多细胞因子中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)即为其中之一[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通过刺激血管内皮细胞增殖和迁移,促进血管新生，其已成为多发性骨髓瘤治疗的新靶点[2]。在多发性骨髓瘤中，COX-2与VEGF间的相关性研究尚少。本实验以多发性骨髓瘤患者为研究对象，研究COX-2与VEGF表达的相关性及临床意义；并应用选择性COX-2抑制剂塞来昔布干预多发性骨髓瘤U266细胞COX-2的活性,初步探讨COX-2对VEGF表达的调控作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 对象 43例MM患者来自于2005年5月～2009年8月我院血液科门诊及住院患者。所有患者均经临床、骨髓像、血免疫球蛋白(Ig)水平、骨骼X线检查确诊,诊断符合张之南《血液病诊断及疗效标准》(第3版)中MM诊断标准。采用国际分期系统(ISS)分期标准，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期患者14例，Ⅲ期患者17例，年龄：59(46～78)岁；β2-MG：3.13(1.23～4.98) mg/l；Ca： 2.66 (2.13～3.25)mmol/l；BMPC%：77 (29～91)%。以同期11例门诊及住院的非血液肿瘤患者骨髓为对照,中位年龄58 (44～76)岁。多发性骨髓瘤细胞株U266及人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/Adr(用于阳性对照)购自中科院上海细胞库。

1.1.2 试剂 Trizol Reagent及Neuclear/cytosol Fractionation Kit购自Invitrogen公司；PCR相关试剂购自Promage公司；人淋巴细胞分离液购自上海博蕴生物科技有限公司；噻唑兰(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；兔抗人COX-2多克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体购自博士德公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购于美国Santa Cruz公司；ECL-plus免疫印迹发光剂购于美国Amersham公司；RPMI1640购自Gibco/BRL公司；小牛血清购自杭州四季青公司；塞来昔布(以DMSO为溶媒)购自辉瑞制药有限公司；阿霉素购自Pharmacia公司；细胞培养箱及超低温冰箱(Forma公司)；倒置显微镜(Olympus公司)；PCR仪(ABI公司)；凝胶成像系统(Syngene公司)；电泳和蛋白转膜设备(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓单个核细胞分离 取样本骨髓液5 ml,低分子肝素抗凝,缓慢加入已装有5 ml人淋巴细胞分离液的离心管中,以2000 r/min离心20 min,提取中间单个核细胞置于1.5 ml EP管中,加入PBS液1 ml吹打混匀,以3000 r/min离心10 min，弃上清液,置于-70℃冰箱中保存备用。

1.2.2 细胞培养 U266细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度条件，于含10%小牛血清的RPMI 1 640培养基中培养，每2～3天传代1次；MCF-7/Adr细胞在上述培养条件下，每2～3天传代1次，以0.2 μg/ml的阿霉素维持其特性。

1.2.3 RNA提取及RT-PCR Trizol提取法提取细胞总RNA,紫外线分光光度计定量，将4 μg RNA逆转录为cDNA后行PCR，基因引物由上海生物工程公司合成，序列如下：COX-2正义链：5’-ATCCTTGCTGTTCCCACCCA-3’，反义链：5’- CTTTGACACCCAAGGGAGTC -3’,退火温度54.5℃,目的基因片段长度为402 bp；VEGF正义链：5’- CTTGCTGCTCTACCTCCAC -3’，反义链：5’- AAATGCTTTCTCCGCTCTG -3’，退火温度55℃，目的基因片段长度为420 bp；β-actin正义链：5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC -3’，反义链：5’- CATGTCTCGATCCCACTTAAC -3’，退火温度59℃，目的基因片段长度为330 bp。PCR反应条件：预变性94℃,5 min,然后94℃ 30 s；退火30 s,72℃,30 s,共30循环；72℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下照相,凝胶成像分析系统扫描定量。以β-actin为内参照。

1.2.4 蛋白提取及Western-blotting 应用Neuclear/cytosol Fractionation Kit 进行蛋白提取(按说明操作)，紫外线分光光度计测定蛋白的吸光值，通过标准曲线求得蛋白浓度，各取30 μg蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，积层胶的浓度5%，分离胶的浓度8%，80V电泳至积层胶和分离胶分界处，调电压为100V直至电泳结束，90 mA电转过夜至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗人COX-2多克隆抗体(1:300)、兔抗人VEGF多克隆抗体(1:300)、兔抗人GAPDH多克隆抗体(1:2000)；4℃孵育过夜，1×TBST溶液洗膜，加入HRP山羊抗兔二抗(1:10000)，室温轻摇2 h，洗膜，多功能激光扫描成像系统 (Typhoon 9400 Variable Mode Imager)扫描并定量。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照。

1.2.5 MTT 取U266细胞，按1×105/孔接种于96孔板中，加入不同浓度的塞来昔布，每个浓度设3个复孔,终体积为200 μl/孔，置5%CO2、饱和湿度、37℃条件下培养，48 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔,继续培养4 h,弃上清，加DMSO 100 μl/孔，水平摇床上摇动10 min,使颗粒完全溶解，酶标仪490 nm处测吸光(OD)值，据OD值计算不同浓度塞来昔布对U266细胞的生长抑制率，软件计算半数抑制浓度(IC50)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 COX-2及VEGF蛋白在MM细胞中的表达

WB法检测显示，在43例MM患者中COX-2阳性表达22例(51.2%),其中Ⅰ期3例,Ⅱ期患者6例,Ⅲ期患者13例；VEGF阳性表达27例(62.8%),Ⅰ期5例,Ⅱ期患者8例,Ⅲ期患者14例；COX-2及VEGF的表达均随疾病ISS分期的提高而进行性增强，各期患者间存在显著的统计学差异(P<0.001)；43例患者中18例共表达COX-2及VEGF，两者的表达具显著的正相关(γ=0.874,P<0.001)；在11例同期住院的非血液肿瘤骨髓中无COX-2表达，2例VEGF微弱表达(图1、表1)。

图1 多发性骨髓瘤患者中COX-2与VEGF蛋白的表达电泳图

注：1为正常对照组；2为Ⅰ期MM患者；3为Ⅱ期MM患者；4为Ⅲ期MM患者

表1 多发性骨髓瘤患者COX-2与VEGF蛋白表达定量

注：Ⅱ期 Ⅲ期与Ⅰ期间相比较，*为P<0.001；Ⅲ期与Ⅱ期相比较，☆为P<0.001

2.2 COX-2及VEGF表达与MM临床预后的相关分析

WB检测结果发现,随年龄、β2-微球蛋白(β2-MG)、血钙(Ca)及骨髓中浆细胞百分比(BMPC)的增加，COX-2及VEGF的表达增强。年龄≥65岁、β2-MG≥4 mg/l、Ca≥3 mmol/l及BMPC≥40%的MM患者，COX-2及VEGF的表达显著高于65岁以下、β2-MG <4 mg/l、Ca<3 mmol/l及BMPC<40%的MM患者(表2)，统计学差异显著(P<0.001)。相关分析显示，年龄、β2-MG、Ca及BMPC等4项预后指标[3,4]与COX-2表达总的相关系数分别为0.692，0.791，0.571及0.856,与VEGF表达总的相关系数分别为0.731，0.645，0.511及0.823,均呈现显著正相关(P<0.001)。年龄、β2-MG、Ca及BMPC在不同的阶段与COX-2及VEGF表达也呈现显著的正相关，见表2。

2.3 U266细胞株中COX-2及VEGF mRNA及蛋白的表达

RT-PCR发现，COX-2及VEGF mRNA在U266细胞中均存在较强表达，与在阳性对照MCF-7/Adr细胞中的表达无差异(P>0.05)；WB结果发现，COX-2及VEGF蛋白表达与mRNA表达相一致。

2.4 MTT结果

塞来昔布作用U266细胞48 h，半数抑制浓度(IC50)为54.41 μmol/L。本实验选用塞来昔布10 μmol/L及20 μmol/L 2个浓度(对U266细胞生长无明显抑制)进行后续实验。

2.5 塞来昔布对U266细胞VEGF表达的影响

与未处理组相比，RT-PCR结果显示塞来昔布10 μmol/L及20 μmol/L作用48 h后VEGF mRNA表达明显下调，统计学差异显著(P<0.01)，且10 μmol/L及20 μmol/L塞来昔布组间也存在显著的统计学差异(P<0.01)。WB结果可见VEGF蛋白表达与mRNA表达相一致，表明塞来昔布可明显下调VEGF的表达，呈现塞来昔布剂量依赖性(图2、图3)。

图2 塞来昔布作用于U266细胞对VEGF mRNA的影响

注：1为Marker； 2为U266；3为U266+塞来昔布10 μmol/L； 4为U266+塞来昔布20 μmol/L;5为MCF-7/Adr

图3 塞来昔布作用于U266对VEGF蛋白表达的影响

注：1为U266；2为U266+塞来昔布10 μmol/L； 3为U266+塞来昔布20 μmol/L； 4为MCF-7/Adr

表2 COX-2及VEGF阳性表达与多发性骨髓瘤临床预后指标的相关性

注：COX-2表达的比较，*为P<0.001；VEGF表达的比较，☆为P<0.001

3 讨论

COX-2是1种诱生性酶。脂多糖、生长因子、细胞因子和癌基因等可迅速而短暂的诱导COX-2表达[5～7]，而在正常组织中COX-2表达微弱，在多种人类实体肿瘤组织中则高表达[8]。COX-2除了参与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及多药耐药外，也与肿瘤的血管新生密切相关[9～11]。 VEGF作为血管新生的关键因子之一，具有调节血管新生、维持肿瘤细胞生存、刺激其增殖、迁移及抵抗凋亡等多种作用，参与肿瘤的进展，已逐渐成为肿瘤的治疗靶点。COX-2及VEGF在多种实体肿瘤中的研究已相对深入。COX-2与VEGF呈现正相关，对其干预可产生良好的抗肿瘤效应。然而，在血液系统肿瘤-多发性骨髓瘤中，COX-2与VEGF的相关性及两者间的表达调控研究资料尚不足，明确两者间的表达调控，对多发性骨髓瘤治疗靶点的选择有重要的临床意义。

本实验发现，COX-2及VEGF在多发性骨髓瘤患者中的阳性表达率较非血液肿瘤患者高，分别为51.2%及62.8%，且两者的表达均随多发性骨髓瘤ISS分期提高而进行性增高，此提示两者可能与多发性骨髓瘤患者的疾病进展相关。

Greipp等[3]在单因素分析的基础上提供了与MM预后相关的指标，包括β2-MG、肌酐(Cr)、年龄、血小板(Plt)、乳酸脱氢酶(LDH)、血红蛋白(Hb)、血清白蛋白(Alb)、BMPC及血钙。闫骅等[4]在单因素分析基础上，筛选出相对有意义的指标，包括性别、年龄、外周血白细胞、血红蛋白、血小板、血钙浓度、血清肌酐、血清白蛋白、异常免疫球蛋白分型、骨损与否及骨髓象原始+幼稚浆细胞和成熟浆细胞之比，并利用Cox’s proportional hazard模型作进一步分析发现，年龄≥65岁、血钙(Ca) ≥3 mmol/l的MM患者预后良。β2-MG超过4 mg/l已确定为预后不良的指标[12]。王豫廉等[13]应用Log-rank和COX回归分析对相关因素作单因素和多因素分析，发现BMPC≥40%的MM患者较<40%的患者预后差。基于以上资料,选择年龄、β2-MG、Ca及BMPC为MM的预后指标进行研究。在MM患者中，本实验应用WB方法对COX-2及VEGF进行表达定量，发现随年龄、β2-MG、Ca及BMPC的增加，COX-2及VEGF的表达增强。相关分析显示，COX-2及VEGF分别与上述4种因素呈现正相关，此提示多发性骨髓瘤患者中COX-2及VEGF与预后密切相关，对两者进行有效干预可能会起到改善预后的作用。

在鼠炎症模型中发现，COX-2可通过PGE2刺激VEGF表达，促进肉芽组织中血管新生，COX-2选择性抑制剂NS398呈现剂量依赖性下调VEGF的表达[14]。本实验对多发性骨髓瘤患者中COX-2与VEGF的表达量进行相关分析发现，COX-2与VEGF呈现显著的正相关(γ=0.874)，也提示MM中二者间可能存在表达调控的关系；随后通过多发性骨髓瘤U266细胞株进行研究，应用COX-2选择性抑制剂塞来昔布对U266细胞株进行干预，发现可有效抑制VEGF mRNA及蛋白的表达，呈现塞来昔布剂量依赖性，其具体的作用机制尚不清，有待进一步研究。

综上所述，COX-2及VEGF在多发性骨髓瘤中高表达，两者与MM的ISS分期及预后密切相关，可作为病情评估的重要指标；干预COX-2可部分下调VEGF的表达，COX-2可望成为多发性骨髓瘤治疗的1个有效的靶点。

[1] LadettoM,Vallet S,Trojan A,et al.Cyclooxygenase-2(COX-2) is frequently expressed in multiple myeloma and is an independent predictor of poor outcome〔J〕.Blood,2005,105(12):4784.

[2] 罗文娟,许文林.多发性骨髓瘤治疗的新靶点-血管内皮生长因子〔J〕.中华血液学杂志,2007,28(10):718.

[3] Greipp PR，Sanmiguel GF，Durie BG.A new international staging system (ISS)for multiple myeloma(MM ) from the international myeloma working group〔J〕.Blood，2003,102(11):118.

[4] 闫 骅，吴 文，赵维莅，等.多发性骨髓瘤的预后评估和多因素模型的建立〔J〕.肿瘤,2003,23(4):312.

[5] Grkovich A,Johnson CA,Buczynski MW,et al.Lipopolysaccharide induced cyclooxygenase-2 expression in human U937 macrophages is phosphatidic acid phosphohydrolase-1 dependent〔J〕.J Biol Chem,2006,2819(44):32978.

[6] Hirsch E,Filipovich Y,Mahendroo M,et al.Signaling via the typeⅠ IL-1 and TNF receptors is necessary for bacterially induced preterm labor in a murine model〔J〕.Am J Obstet Gynecol,2006,194(5):1334.

[7] Tammali R,Ramana KV,Singhal SS,et al.Aldose reductase regulates growth factor-induced cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin E2 production in human colon cancer cells〔J〕.Cancer Res，2006,66(19):9705.

[8] Soslow R A,Dannenberg A J,Rush D,et al.COX-2 is expr e-ssed in human pulmonary,colonic and mammary tumors〔J〕.Cancer,2000,89(12):2637.

[9] Ohno S，Ohno Y，Suzuki N，et al.Cyclooxygenase-2 expression correlates with apoptosis and angiogenesis in endometrial cancer tissue〔J〕.Anticancer Res，2007，27(6A):3765.

[10] 陈 琛，许文林，方莉莉，等.塞来昔布预防MCF-7细胞获得性耐药发生〔J〕.肿瘤，2009,29(11):1049.

[11] Cianchi F，Cortesini C，Fantappie O，et al.Cyclooxygenase-2 activation mediates the proangiogenic effect of nitric oxide in colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2004,10(8)：2694.

[12] Ernest Beutler等主编，宋善俊等主译.威廉姆斯血液学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2004：1342～1362.

[13] 王豫廉，王蔓萍，陈波斌，等.多发性骨髓瘤患者生存因素分析〔J〕.临床血液学杂志，2000,13(3)：114.

[14] Ajoy K G,Noriyasu H,Hisae N,et al.Cyclooxygenase-2-mediated angiogenesis in carrageenin-induced granulation tissue in rats〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2000,295(2):802.