张丹丹 张玉泉 季玉琴 周业娣 糜媛媛

近年来，有研究表明HPV的E6、E7编码蛋白，通过不同的泛素-蛋白酶体途径导致宫颈细胞癌变，其中HPV E6-E6AP-P53途径是目前研究最多的途径，已能在体外完全模拟建。

泛素-蛋白酶体途径作为HPV导致宫颈癌的重要机制，研究该途径的抑制剂对宫颈癌的治疗可能产生巨大影响，硼替佐米(bortezomib,PS-341)是首个被用于临床的蛋白酶体抑制剂。本实验旨在观察PS-341对宫颈癌细胞株SiHa细胞毒性影响的研究，为临床治疗提供有力证据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养

人类宫颈癌SiHa细胞株，购于上海拜力生物科技有限公司。购买的人宫颈癌SiHa细胞株接种在25 cm2的培养瓶中，包装无破损，镜下观察形态正常，放量37℃、5%CO2培养箱中常规培养。用含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM完全培养液(南京基然生物科技发展有限公司)培养，0.25%胰酶(南京基然生物科技发展有限公司)消化传代。

1.2 药物及试剂

注射用硼替佐米(万珂)，美国Ben Venue Laboratories Inc.生产，西安扬森制药有限公司分装，进口药品注册证号：H20050308，分装批准文号：国药准字J20050042。购于南京众协药房有限公司，用无菌水稀释成1 mg/ml备用。Hoechst染色试剂盒购于海门碧云天生物科技研究所，Annexin-V FITC kit试剂盒和细胞DNA(细胞周期)检测试剂盒，均购于南京凯基生物科技发展有限公司。

1.3 Hoechst染色检测细胞凋亡

将干净无菌的盖玻片置于6孔板内,接种细胞过夜。当细胞铺满盖玻片50%～80%时,依次加入0 nmol/L、20 nmol/L 、40 nmol/L 、60 nmol/L PS-341，分别作用24、48、72 h后,吸尽培养液,加入0.15 ml的固定液,固定过夜。去固定液,用PBS 洗2 遍,每次3 min,吸尽液体,加入0.5 ml Hoechst染色液,避光染色5 min,晃动数次,封片,荧光显微镜下观察。

1.4 FCM测定细胞凋亡率

取对数生长期的细胞常规消化制成单细胞悬液，接种于6孔培养板内(每孔1 800 μl细胞悬液，加药200 μl)，待细胞贴壁后给予干预因素，作用后用胰酶消化制成单细胞悬液并收集细胞于离心管中，2 000 rpm离心5 min，吸弃上清。用PBS洗涤细胞2次(2 000 rpm离心5 min)，收集1～5×105个细胞，加入500 μl Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，加入5 μl Propidium Iodide，混匀，室温、避光、反应5～15 min。1h内应用流式细胞仪进行检测分析。实验重复3次，取平均值和标准差。

1.5 FCM测定细胞周期

取对数生长期的细胞常规消化制成单细胞悬液，接种于6孔培养板内(每孔1 800 μl细胞悬液，加药200 μl)，待细胞贴壁后给予干预因素，作用后用胰酶消化制成单细胞悬液并收集细胞于离心管中，2000 rpm离心5min，吸弃上清。PBS洗涤细胞1次，2000 rpm离心5 min，吸弃上清，并调整细胞密度为1×106/ml，制备的单细胞悬液用体积分数70%的乙醇固定，4℃保存过夜。染色前用PBS洗去固定液，加100 μl RnaseA 37℃水浴30 min，再加100 μl PI染色混均，4℃避光30 min。上机检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。实验重复3次，取平均值和标准差。

2 结果

2.1 Hoechst染色结果

未加入PS-341作用的SiHa细胞核形态规整，大小正常，染色稀疏，并且不随着时间的改变而发生变化。20 nmol/L PS-341作用24 h后，即发生细胞核固缩浓染，出现凋亡的形态学改变，并且随着PS-341作用浓度的增高，细胞核固缩浓染数目逐渐增多，形态学改变越来越明显。加入相同浓度的PS-341后，随着作用时间的延长，细胞核固缩浓染的数目也越来越多，凋亡现象越来越明显，60 nmol/L PS-341作用72 h后，细胞核已完全呈碎裂状致密浓染。

2.2 FCM测定细胞凋亡率

不同浓度PS-341作用不同时间后，与阴性对照组比较，SiHa细胞早期凋亡率显著增高(P<0.01)；随着作用浓度的升高和作用时间的延长，早期凋亡细胞比例逐渐增大，20 nmol/L PS-341作用48 h与作用72 h比较，早期凋亡细胞比例增大(P<0.05)，其余各组间比较，早期凋亡细胞比例明显增大(P<0.01)；60 nmol/L PS-341作用72 h时，早期细胞凋亡率为68.07%，与其他组相比显著增高(P<0.01)。实验组中PS-341浓度为60 nmol/L、作用时间为72 h时，对SiHa细胞的凋亡作用最强，见图1，表1。

表1 不同浓度PS-341作用不同时间SiHa细胞凋亡情况

﹡为与阴性对照组相比，P<0.01；△为与48h相比，P<0.05；其余组间相比，P<0.01

2.3 FCM测定细胞周期

不同浓度PS-341作用SiHa细胞不同时间后，与对照组比较，G0/G1期细胞比例增大(P<0.01)，S期细胞比例下降(P<0.01)。随PS-341浓度增高和作用时间的延长，G0/G1期细胞所占比例与细胞凋亡率呈同步变化趋势，而S期细胞比例则随作用浓度升高和作用时间延长而逐渐下降,60 nmol/L PS-341作用48 h与作用24 h相比，S期细胞比例下降(P<0.05)，其余各组相比，G0/G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例下降，细胞生长阻滞于G0/G1期，各组间差异显著(P<0.01)，见图2，表2。

图1 不同浓度PS-341作用不同时间对SiHa细胞凋亡率的影响

图2 不同浓度PS-341作用不同时间对SiHa细胞周期的影响

PS-341浓度(nmol/L)24 hG0/G1SG2/M48 hG0/G1SG2/M72 hG0/G1SG2/M0(阴性对照组)52.68±0.9837.43±1.1310.87±0.8551.34±1.0238.37±0.639.89±0.7452.37±0.8636.85±1.0410.12±0.942059.86±0.73﹡30.56±0.919.98±0.8865.35±1.16﹡26.64±1.039.47±0.9670.98±0.62﹡21.54±0.83﹡8.49±0.974068.04±1.13﹡23.78±0.95﹡9.02±0.7873.03±0.67﹡18.33±1.02﹡9.53±0.8978.61±1.06﹡11.23±0.95﹡10.24±0.816080.76±0.97﹡7.31±0.81﹡11.73±1.0885.14±0.62﹡5.62±1.02﹡△9.08±0.7688.47±0.58﹡3.53±0.79﹡8.01±0.94

﹡为与阴性对照组相比，P<0.01; △为与作用24h相比，P<0.05，其余各组间相比，P<0.01

3 讨论

经过大量的研究调查，目前认为HPV是宫颈癌的主要致病因子[1]，国外Nubia Munoz等[2]，国内陈少敏等[3]均有报道绝大部分宫颈癌中均可发现有HPV感染。近年来在研究HPV的过程中，有报道HPV可通过泛素-蛋白酶体途径导致宫颈细胞癌变，其中HPV E6-E6AP-P53是一条相当重要的途径。Hougardy 等[4]将26S蛋白酶体抑制剂MG132与细胞凋亡刺激因子rhTRAIL(人复合TNF相关的凋亡诱导配体)联合作用于宫颈癌多种细胞系，结果发现细胞中野生型p53的表达量增加，并且对细胞凋亡刺激因子rhTRAIL敏感性增强。因此，能否从HPV的致癌机制入手，通过抑制途径中的关键步骤来找到治疗宫颈癌最佳方案。

目前，在26S蛋白酶体抑制剂中，PS-341已被美国FDA批准将该药用于治疗复发性、难治性多发性骨髓瘤。因此，本人选用该药作为本课题的研究用药。人类宫颈癌SiHa细胞来源于人宫颈上皮鳞状细胞癌，肿瘤分期Ⅱ级，NF-κB活性较强，p53+，为感染HPV16型，HPV16属于高危型HPV，符合本实验要求。本课题进行体外实验，将不同浓度的PS-341作用于宫颈癌SiHa细胞系，并设定不同的作用时间，以观察PS-341对宫颈癌SiHa细胞是否具有诱导凋亡作用，以及诱导作用与PS-341浓度、作用时间之间的关系

Hoechst染色以及FCM测细胞早期凋亡率的实验结果均提示PS-341对SiHa细胞有诱导凋亡作用，并且诱导凋亡作用与作用浓度、作用时间呈正比。FCM测定细胞周期的结果显示，与阴性对照组的SiHa细胞相比，加入PS-341的处理组细胞G0/G1期细胞所占比例随着浓度的增加及作用时间的延长而逐渐上升，而S期细胞的比率则随着浓度的增加及作用时间的延长则逐渐下降。有文献提示PS-341将细胞周期停止于G2/M期[5]，但Fujita 等[6]在研究PS-341对胃癌细胞治疗作用的研究中提示，小剂量的PS-341将细胞周期阻滞于G1期。本实验中本实验提示PS-341诱导肿瘤细胞凋亡并将细胞阻滞于G0/G1期,表明PS-341抑制skov-3细胞DNA前期的合成，阻滞细胞进入周期复制，从而引起细胞凋亡。

UPP通过26S蛋白酶体降解一些与凋亡相关的蛋白,如转录因子,凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等,发挥调控细胞凋亡的作用，目前蛋白酶体降解蛋白的机制还不十分清楚。有研究表明，泛素中的E3RNG家族成员癌基因调节蛋白鼠双微粒体(murine double minute 2,MDM2) 是1种癌基因蛋白，具有负反馈调节p53的作用。MDM2 含有环指样结构域,具有泛素连接酶E3 的作用 ,可以促进p53产物从核内向细胞质转运,使之被泛素化后被26S蛋白酶体降解[7]。抑癌基因p53的表达产物是细胞内重要的凋亡调控因子。该产物可以通过激活一系列靶基因,如下调bcl22的活性,上调bax活性,诱导死亡受体的Fas基因和FasL的表达等实现凋亡调控功能。本实验在体外初步证实了PS-341可诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡，将细胞周期阻滞于G1期，并且随着PS-341浓度的不同、作用时间的不同，对细胞的作用能力亦不相同。在本实验所设定的浓度及作用时间显示，浓度越高，作用时间越长，其对SiHa细胞的影响越大。当然，对于PS-341对SiHa细胞的作用、影响，还有待进一步研究，其作用机制、最佳作用时间及最佳作用浓度等问题还有待解决。

[1] Adersson S ，Rylander E，LarssonB，et al.The role of human papillomavirus in cervical carcinoma carcinogenesis〔J〕.European Cancer,2001，37：246.

[2] Nubia Munoz，Xavier Bosch F，Silvia de Sanjose，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer〔J〕.The New England journal of medicine,2003,348:518.

[3] 陈少敏，张友忠.早期宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中Ki-67、PCNA的表达及其与HPV感染相关性的研究〔M〕.中国优秀硕士论文库,2007:5.

[4] Hougardy BM，Maduro JH，vander Zee AG，et al.Proteasome inhibitor MG132 sensitizes HPV-positive human cervical cancer cells to rhTRAIL-induced apoptosis 〔J〕.Cancer,2006，118(8)：1892.

[5] 沈 子,许啸声.泛素- 蛋白酶体及其抑制剂〔J〕.现代肿瘤医学，2006，14(11)：1454.

[6] Fujita T,Doihara H.Antitumor effect and drug interactions of the proteasome inhibitor bortezomib(PS-341) in gastric cancer cells 〔J〕.Anti-cancer drugs，2007，18(6):677.

[7] Brooks CL,Gu W.p53 ubiquitination : Mdm2 and beyond 〔J〕.Mol Cell,2006 ,21 (3):307.