邹平安 刘志礼 罗庆丰 王 高 周 扬 舒 勇

骨肉瘤是1种常见于青少年的原发性恶性骨肿瘤，在0～14岁的青少年中和0～19岁青少年中的发病率分别为每年3.5～4.6/百万人和每年4.6～5.6/百万人[1]，化疗是其主要的治疗手段之一。表阿霉素是骨肉瘤化疗的常见药物之一，但临床证实骨肉瘤细胞对表阿霉素易产生耐药性。浅蓝菌素能在体内、外诱导人多种恶性肿瘤细胞凋亡、抑制增殖[2，3]。本实验旨在探讨浅蓝菌素是否能增强表阿霉素骨肉瘤细胞U2-OS的抑制作用，为骨肉瘤协同用药提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

骨肉瘤细胞株U2-OS购自北京协和医科大学生物细胞库;F12型培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司;胰蛋白酶冻干粉(含EDTA)购自美国Sigma公司;表阿霉素购自浙江海正药业公司,溶于灭菌去离子水中制备成10 mg/ml的母液,培养基稀释成工作浓度,4℃储存;DMSO、MTT、浅蓝菌素(Cerulenin)购自美国Sigma公司,溶于二甲基亚砜(DMSO)中制备成50 mg/ml的母液，培养基稀释成工作浓度(用培养基稀释后工作液DMSO浓度<1%)，-20℃储存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 U2-OS细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的F12型培养液中，其中青霉素、链霉素各100 U/ml，于37℃、5%CO2的饱和湿度孵育箱中培养。做细胞生长曲线，对数生长期处于细胞传代后第3～5天，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞增殖抑制实验 调整细胞数为1×104/ml接种于无菌96孔培养板，每孔100 μl，继续培养12 h，待细胞贴壁后，表阿霉素单独作用组分别给予含表阿霉素浓度分别为1 μg/ml,2.5 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml,25 μg/ml的培养液200 μl；浅蓝菌素单独作用组分别给予含浅蓝菌素浓度分别为1 μg/ml,5 μg/ml，10 μg/ml,20 μg/ml，50 μg/ml的培养液200 μl。同时设立DMSO的阴性对照组、F12培养基空白对照组。每组每个浓度下设5个复孔，培养24 h后，每孔加入20 μl的MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后，弃上清，加入DMSO，终止反应。微振荡5 min后，于酶标仪波长490 nm处测吸光度(A)。以上各组实验重复3次。抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。用细胞存活率对剂量对数作图并按作图法求出IC50值。选取2种药物最小浓度以及2种药物最接近IC50且小于IC50的浓度做联合实验。(即选用1 μg/ml表阿霉素+1 μg/ml浅蓝菌素以及10 μg/ml表阿霉素+20 μg/ml浅蓝菌素做联合实验)。采用Q值判断浅蓝菌素和表阿霉素联合用药的性质。Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)。公式中Ea代表单药A的抑制率，Eb代表单药B的抑制率，Ea+b代表两药联用的抑制率。Q 值>1.15为两药协同作用，0.85≤Q≤1.15为相加作用，Q<0.85为拮抗作用。

2 结果

U2-OS细胞经不同浓度表阿霉素、浅蓝菌素单独处理24 h后，细胞生长程度受到不同程度的抑制，且抑制程度依赖于药物剂量的增加，其IC50分别为10.83 μg/ml和26.88 μg/ml(图1、2)。各实验组与对照组抑制率比较差异有显著性(P<0.05)。在联合组中，U2-OS细胞经联合药物处理24 h后，细胞的抑制率明显增高；表阿霉素与浅蓝菌素联合浓度(1μg/ml+1 μg/ml)组为两药协同作用；(10 μg/ml+20 μg/ml)组为两药相加作用见表1。

图1 MTT检测表阿霉素对U2-OS细胞增殖的抑制率

图2 MTT检测浅蓝菌素对U2-OS细胞增殖的抑制率

表1 MTT检测联合药物对U2-OS细胞增殖抑制情况(n=3)

3 讨论

表阿霉素为蒽环类药物，与阿霉素的区别只是在氨基糖部分4’位的羟基由顺式变成反式。由于表阿霉素毒副作用更低，所以临床上将表阿霉素作为骨肉瘤化疗的常用药物。表阿霉素对细胞周期各阶段均有作用，为细胞周期非特异性药物。但是对乳腺癌的研究发现，阿霉素也能够激活NF-KB的活性而抑制肿瘤细胞的凋亡，影响其抗肿瘤效果[4]。

浅蓝菌素是蓝色头孢霉的自然代谢产物，化学名为(2R，3S)-2，3-环氧-4，酮-7，10-反，反12碳二烯酸酰胺。浅蓝菌素可以特异性地以环氧部位与脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)中的β-酮酰基合成酶的活性部位半胱氨酸巯基形成共价结合，抑制FAS活性，其可能的信号通路是通过抑制线粒体途径[5]和抑制NF-KB的表达及活性而促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖[6]。

本实验结果证实U2-OS细胞经不同浓度表阿霉素、浅蓝菌素处理24 h后，细胞生长程度受到不同程度的抑制，且抑制程度依赖于药物剂量的增加。联合用药后，细胞抑制率明显增高，Q值分别为1.24(1 μg/ml表阿霉素+1 μg/ml浅蓝菌素)和0.96(10 μg/ml表阿霉素浓度+20 μg/ml浅蓝菌素)。

本实验只证实浅蓝菌素能增强表阿霉素对人骨肉瘤细胞(U2-OS)抑制作用，但其机制是否与抑制NF-KB的表达及活性有关仍需进一步研究。

[1] Ottaviani G,Jaffe N.The epidemiology of osteosarcoma〔J〕.Cancer Treat Res,2009,152:3.

[2] Silva SD,Perez DE,Nishimoto IN,et al.Fatty acid synthase expression in quamous cell carcinoma of the tongue：clinicopathological findings〔J〕.Oral Dis,2008,14(4):376.

[3] Walter K,Hong SM,Nyhan S,et al.Serum fatty acid synthase as a marker of pancreatic neoplasia〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(9):2380.

[4] Das KC，White CW.Activation of NF—kappa B by antineoplastic agents.Role of protein kinase C〔J〕.J Biol Chem，1997，272：14914.

[5] 黄 伟，舒 勇，黄山虎，等.浅蓝菌素在诱导骨肉瘤细胞株U2-OS凋亡过程中对 Bcl-2和Bax的影响〔J〕.江西医学院学报，2009，49(3)：22.

[6] 黄培林，金月玲，朱世能,等.NF-kb在脂肪酸合成酶制剂诱导人结肠癌lovo 细胞凋亡中的作用〔J〕.肿瘤防治研究，2010，28(4):296.