金志良 孙新臣 徐炎华

高迁移率族蛋白组A1(high mobility group A1,HMGA1)可能是1种癌基因，它能促进细胞恶性转化、肿瘤细胞增殖和侵袭，抑制其凋亡。近年来，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的出现，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。本研究旨在构建HMGA1siRNA慢病毒载体并转染肺腺癌细胞SPCA-1，沉默HMGA1的表达，观察其对细胞化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

慢病毒载体系统(上海吉凯基因公司)；吉西他滨(江苏豪森药业股份有限公司)；RPMI1640(GIBCO公司)；HEPES(Amresco公司)；胎牛血清(天津TBD公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Siga公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)和TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(大连宝生物公司)；羊抗人HMGA1多抗(Santa Cruz 公司)，小鼠抗羊IgG(北京中杉公司)；人肺腺癌细胞株SPCA-1、慢病毒包装细胞293T细胞株和大肠杆菌菌株DH5α(中科院上海细胞库)。

1.2 细胞培养

人肺腺癌细胞株SPCA-1于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，置于37℃下5%CO2水饱和培养箱中。细胞贴壁生长良好，每3天传代1次。

1.3 人HMGA1基因shRNA模板序列的设计

前期实验筛选出最有效的HMGA1-siRNA(siHMGA1)序列是:AAACCACCACAACTCCAGGAA。以此序列为模板，根据碱基互补配对原则设计寡核苷酸链，在互补两条序列中间加入Loop,序列为TTCAAGAGA，使寡核苷酸可以形成发夹结构,寡核苷酸序列两端分别带有酶切位点。正义链: 5′-TAAAC CACCA-CAACTCCAGGAATTCAAGAGATTCCTGGAGTTGTGGT-GGTTTTTTTTTC-3′；反义链:5′-TCGAGAAAAAAAAACCACCACAACTCCAGGA ATCTCTTGAATTCCTGGAGTTGTGGTGGTTTA-3′。阴性对照双链寡核苷酸转录产物所形成的siRNA的作用序列为：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，此序列不与任何人类基因序列同源。

1.4 实验方法

1.4.1 siHMGA1慢病毒表达载体的构建 按照设计好的双链DNA进行合成、退火，DNA稀释到1 μg/μl，退火反应体系如下：DNA模板单链正义链 5 μl，DNA模板单链反义链5 μl，5×Universal Buffer 20 μl，dd H2O 70 μl，总体积100 μl混匀，90℃温育4 min，70℃温育10 min，缓慢冷却至室温，稀释至终浓度100 ng/μl。将退火产物与线性化处理的载体片段连接，将连接产物转化到DH5α感受态细胞，将150 μl已转化的感受态细胞转移到含20 mmol/L MgSO4和Amp抗性的SOB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养16 h进行阳性克隆筛选。

1.4.2 PCR和DNA测序鉴定 挑取10个单菌落，使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增，其中上游引物：5’- GCCCCGGTTAATTTGCATAT -3’；下游引物：5’- GTAATACGGTTATCCACGCG -3’。PCR体系如下：上下游引物各0.4 μl,MgCl20.5 μl，Taq polymerase 0.2 μl，DNTPs(2.5 mmol/L) 0.8 μl，ddH2O 14.7 μl,10×buffer 2.0 μl，Template 1 μl。 PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(从第二步到第四步共30 cycle)，最后72℃延伸6 min。 PCR反应结束后,取PCR产物5 μl上样，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。挑选阳性克隆,接菌,过夜培养后，应用质粒抽提试剂盒提取质粒，抽提好的质粒应用载体上的引物送测序(上海英俊公司完成)。

1.4.3 携带siHMGA1的慢病毒重组体的包装 胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，调整细胞密度为0.6×109/ L，接种于15 ml的细胞培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞密度达70%～80%时进行转染。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒质粒共转染293T细胞，转染48 h后，收集细胞上清液，4℃、4 000 r/ min离心10 min除去细胞碎片，以0.45 μm滤器过滤上清液于40 ml超速离心管中。把病毒粗提液样品加入到过滤杯中并盖上盖子，将过滤杯插到含滤过液收集管中，4 000 r/ min离心约10～15 min，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，过滤杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装到病毒保存管中，-70℃保存。

1.4.4 细胞转染 胰蛋白酶消化对数生长期的SPCA-1细胞，调整细胞密度为0.6×109/ L，接种于15 ml的细胞培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞密度达70%～80%时进行转染。构建好的HMGA1siRNA慢病毒质粒和阴性siRNA慢病毒质粒,按MOI值50转染SPCA-1细胞，并分为阳性组、阴性组和空白组(未转染的细胞)，转染后4天，显微镜下观察细胞生长良好。

1.4.5 RT-PCR检测HMGA1mRNA表达 各组对数生长期的细胞用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)抽提总RNA。RT-PCR步骤按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0说明书进行。HMGA1引物序列为5/-CTACTTTGCTTCCGCCACTC-3/，5/-GTGGCCCCTACACCCTTTAT-3/，扩增长度为419 bp；内参β-actin引物序列为5/-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3/,5/-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3/,扩增长度为621 bp。以上引物均由上海生物工程公司合成。RT条件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。PCR条件：94℃ 2 min,94℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 30 s，28个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(100V,30 min)。Imagemaster VDS凝胶成像系统成像。

1.4.6 Western印迹检测HMGA1蛋白表达 用细胞裂解缓冲液裂解细胞，BCA 蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度。取2 0 μg蛋白经1 0 %聚丙稀酰胺凝胶电泳，1 2 0V 恒定电压转膜2 h，室温封闭1 h，4 ℃封闭过夜。HMGA1一抗工作浓度为1∶500，作用1 h; 二抗工作浓度1∶1 000，作用50 min，β-actin 一抗工作浓度为1∶600，二抗工作浓度为1∶1 000，抗体的反应时间同HMGA1。然后按说明书滴加ECL发光液，反应5 min 后，入暗室曝光10 min，显影、照相。

1.4.7 MTT检测细胞增殖情况 取阳性组和阴性组指数生长期细胞，以5 000个/孔接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，24 h后换为不同浓度吉西他滨(0.005 μg/ml、0.05 μg/ml、0.5 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml)的培养液，并设空白对照组和阴性对照组。培养72 h后每孔加MTT 20 μl(5 mg/ml)再培养4 h，弃上清，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物充分溶解。置酶联免疫检测仪上，570 nm波长下，以空白孔调零，测定各孔光吸收值(A)。按下列公式计算细胞抑制率：

抑制率(%)=(1-给药组平均A值/对照组平均A值)×100%

1.4.8 流式细胞术检测 将阳性组和阴性组指数生长期的细胞培养24 h后，换成含不同浓度吉西他滨(0.05 μg/ml、0.5 μg/ml、5 μg/ml)的培养液干预72 h后，收集约106个细胞，用PBS洗涤细胞2次。按试剂盒说明操作后应用流式细胞仪检测。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 携带目的基因慢病毒质粒的鉴定

2.1.1 PCR结果 PCR反应结束后,取产物5 μl上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳，重组慢病毒载体的PCR产物是381 bp(插入片段59 bp)，经双酶切后没有插入片段的pGCL-GFP空载体PCR产物是322 bp，鉴定结果与预期的相符，见图1。

2.1.2 DNA测序鉴定 DNA测序的结果与实验要求的DNA序列完全一致(图2)。对于测序结果正确的克隆，进行不含内毒素质粒的提取，提取完成之后，用蛋白核酸测定仪(Eppendorf,PS232C) 测量Lentivector-siHMGA1 plasmid DNA，D260/D280 值为1.9，表明获得了纯度和完整性均较高的质粒DNA。

图1 慢病毒质粒PCR产物电泳图

1为空白对照 (ddH2O)，2为DNA 标记，3为阴性对照(空载体322 bp)，4～8为HMGA1慢病毒质粒(381 bp)

图2 慢病毒质粒DNA测序结果

2.2 RNAi下调SPCA-1细胞HMGA1mRNA表达水平

半定量RT-PCR结果，以琼脂糖凝胶电泳条带的亮度来判断HMGA1的mRNA表达高低，结果显示阳性组HMGA1mRNA的表达量明显低于阴性组和空白组(后两组间无差异，P>0.05)，说明干扰的效率很高(图3)。

图3 RT-PCR检测结果

1为DNA标记，2为阳性组，3为阴性组，4为空白组

2.3 RNAi下调SPCA-1细胞HMGA1蛋白表达水平

Western blot结果以蛋白条带的亮度来判断HMGA1的蛋白表达高低，结果显示阳性组HMGA1 mRNA的表达量明显低于阴性组和空白组，说明干扰的效率很高(图4)。

图4 Western blot检测结果

1为阳性组，2为阴性组，3为空白组

2.4 吉西他滨对阳性组、阴性组细胞的体外增殖抑制效应

分别以0.005 μg/ml、0.05 μg/ml、0.5 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml吉西他滨处理各组细胞72 h后，阳性组较阴性组抑制率明显升高 (图5)。根据MTT吸光值计算IC50值，阳性组为(0.309±0.003)μg/ml，阴性组为(0.653±0.003)μg/ml，两组比较具有差异性(P<0.05)。

2.5 吉西他滨对阳性组和阴性组细胞凋亡率的影响

细胞经0.05 μg/ml、0.5 μg/ml和0.5 μg/ml吉西他滨处理72 h后，阳性组凋亡率分别为(9.53±0.42)%、(16.67±0.45)%和(25.40±0.79)%，阴性组凋亡率分别为(7.43±0.21)%、(11.00±0.20)%和(14.93±0.31)%，差异具有显著性﹙P<0.05﹚，见图6。

图5 不同浓度吉西他滨作用下2组细胞生长抑制曲线和IC50值

图6 不同浓度吉西他滨作用下2组细胞凋亡率情况

A～C为阳性组；A1～C1为阴性组

3 讨论

慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene silencing,PFGS)。dsRNA经RNA沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex,RISC)降解成21-23nt的小干扰RNA(short Interference RNA，siRNA)，并以其为模板，特定位点和特定间隔地降解与之序列互补的mRNA。RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点。近年来的研究表明以慢病毒为载体可以明显增加RNA干扰的转染和干扰效率[1]。因此，本实验选择慢病毒为载体。本实验结果表明，通过慢病毒转染HMGA1基因的干扰序列到肺癌细胞后，无论是在RNA水平和蛋白水平目的基因几乎不表达，说明该种方法效率高、可操作性强。成功的下调肺癌细胞中HMGA1基因的表达为我们后面的实验奠定了基础。

人的HMGA1基因是高迁移率族蛋白HMG(high mobility group protein)中的一员，又称为HMGI(Y)基因，位于染色体的6p21。研究表明正常成年个体组织中HMGI(Y) 基因很少表达甚至不表达,然而在胚胎的发育过程中和恶性肿瘤中的表达水平却很高，而且一般来说，HMGI (Y) 基因表达水平的高低与肿瘤的恶性程度有关[2]。这与它的结构和功能有关，它最显著的特点是拥有3个相似但又相互独立的特殊结构，该结构能和DNA中富含A-T序列的小沟结合，称为A-T沟序列，它含有3个碱性八肽的DNA结合模体，该模体的核心结构是BBXRGRXB,B(G或R)代表碱性氨基酸,X是甘氨酸或脯氨酸[3]。这类蛋白质通过A-T沟序列优先与DNA小沟中富含AT的序列结合，诱导增强子所调控的启动子发生结构特异性的变化，使相应的转录因子在同一识别位点与大沟发生相互作用，或者直接与HMGI(Y) 蛋白发生作用，从而进一步增强转录，调控肿瘤相关基因表达和细胞分化[4,5]。从而使正常细胞恶变和转化，肿瘤细胞侵袭和转移。本实验RT-PCR和Western blot证明该基因在肺癌细胞中的表达也很高，表明HMGA1基因可能对肺癌细胞生长、分化和恶变起到调控作用，有可能是肺腺癌细胞发生发展的关键因子之一。

当通过RNA干扰技术下调肺癌细胞中的HMGA1基因表达后，在吉西他滨的干预下阳性组生长抑制率明显高于阴性组进一步说明：一方面该基因可能调控肺癌细胞分化、生长和增殖以及肿瘤细胞相关基因表达,当它表达下调后,吉西他滨抑制阳性组细胞生长的能力相对增强；另一方面说明该基因是影响肺癌细胞化疗敏感性的重要基因之一。后者与近年来文献的报道是一致的[6]。研究还发现在相同浓度吉西他滨的作用下，低表达HMGA1的阳性组比高表达HMGA1阴性组凋亡率要高，表明HMGA1基因表达下调后药物敏感性的改变可能是和细胞凋亡机制有关。近年来，研究表明HMGA1具有抗凋亡的作用，其具体抑制凋亡的机制还不是很清楚，可能是通过作用于凋亡基因p53的活化剂HIPK2，阻止它进入细胞核，抑制它的活化，从而抑制p53基因的功能，阻止细胞凋亡[7,8]；也可能是通过激活磷脂酰肌醇3激酶和(或)蛋白激酶B信号途径(PI3K/Akt)中的Akt，后者进一步抑制凋亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-9的活性，从而抑制细胞凋亡[6]。另外，吉西他滨抗肿瘤作用之一就是诱导细胞凋亡。所以，当肺癌细胞中的HMGA1表达下调后，其抗凋亡作用减弱，吉西他滨诱导阳性组细胞凋亡的比例增加。

综上所述，HMGA1基因表达下调后能够增加肺癌细胞对吉西他滨的敏感性，其机制可能和抑制其抗凋亡作用有关，具体的信号途径还不是很清楚，有待进一步研究。

[1] 张盛周,张宏霞,潘飞燕,等.腺病毒介导的siRNA下调c-Met表达抑制肝癌细胞生长〔J〕.肿瘤防治研究,2008,36(5):10.

[2] Liau SS，Rocha F，Matros E,et al.High mobility group AT-hook 1 (HMGA1) is an independent prognostic factor and novel therapeutic target in pancreatic adenocarcinoma 〔J〕.Cancer,2008,113(2):302.

[3] Duncan.HMGA1 mediates the activation of the CRYAB promoter by BRG1〔J〕.DNA Cell Biol,2007,26(10):745.

[4] Matta MK，Panagiotidis CA.High-mobility group protein A1 binds herpes simplex virus gene regulatory sequences and affects their expression〔J〕.Arch Virol,2008,153(7):1251.

[5] Takamiya R，Baron RM，Yet SF，et al.High mobility group A1 protein mediates human nitric oxide synthase 2 gene expression〔J〕.FEBS Lett,2008,582(5):810.

[6] Liau SS，Whang E .HMGA1 is a molecular determinant of chemoresistance to gemcitabine in pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,2008,14(5):1470.

[7] De Martino I，Visone R，Fedele M,et al.Regulation of microRNA expression by HMGA1 proteins〔J〕.Oncogene,2009,28(11):1432.

[8] Pierantone GM,Rinaldo C,Mottolese M,et al.High-mobility group A1 inhibits p53 by cytoplasmic relocalization of its proapoptotic activator HIPK2〔J〕.The Journal of Clinical Investigation,2007,117(3):693.