余小平，程道梅，彭晓莉，贾皓，韩彬，2

（1.成都医学院公共卫生系，四川 成都 610083；2.遵义医学院公共卫生学院，贵州 遵义 563003）

血管内皮细胞（ECs）的活化、肿瘤细胞及ECs中促血管生成因子分泌的增加均可促进肿瘤的血管生成［1－3］。血管内皮生长因子（VEGF）是促肿瘤血管生成中最强的生长因子，通常由好氧细胞产生。VEGF与ECs表面的VEGF受体结合，不仅可通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路提高原ECs的活性［4］，还增加基质金属蛋白酶（MMPs）的分泌［5］。1987年，Akiyama等［6］首次证实染料木黄酮（genistein，Gen）是一种强效的蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）抑制剂。前期的研究证实，Gen可通过抑制HER－2／neu受体磷酸化和PTK活性而下调促血管生成因子的表达［7］，ECs参与了实体肿瘤的血管生成［8］。本研究旨在探讨MAPK信号通路在Gen抑制ECs活性中的作用，揭示Gen抗血管生成的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Gen标准品和VEGF购自美国Sigma－Aldrich公司。［γ－32P］ATP购自北京Yahui生物医学工程公司。氨基端激酶（JNK）抑制剂（SP600125）、p38抑制剂（SB203580）和 ERK1／2抑制剂（PD98059）购自美国Promega公司。基质金属蛋白酶抑制因子（MMP）－2／－9、TIMP－2／－9 酶 链 免 疫 吸 附 测 定（ELISA）试剂盒、Caspase－3活性分析试剂盒购自武汉Boster生物科学有限公司。抗phospho－JNK、抗phospho－p38、抗 phospho－ERK1／2、抗 phospho－MMP－2、抗phospho－MMP－9、通用型二抗以及增强化学发光系统（ECL）购自北京Santa Cruz生物技术公司。Ⅱ型和Ⅳ型胶原酶分析试剂盒购自日本Yagai公司。

1.2 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养和处理

采用胰酶消化法分离健康非异常妊娠母亲经阴道所产健康胎儿的新鲜脐带HUVECs，然后在含有20%特级胎牛血清、100U／ml盘尼西林、100μg／ml链霉素和75μg／ml内皮细胞生长添加剂（ECGS）的RPMI1640培养液，37℃，5%CO2条件下培养。经形态学及免疫细胞化学法（F－3520抗体）鉴定后将第3～6代HUVECs接种于24孔培养板，分别用5 μg／ml VEGF或1、10、100μmol／L Gen处理24h。……