李少春 段 斐 程 炜 高 文 崔 娜

(河北大学基础医学院，河北 保定 071000)

绝经后骨质疏松(OP)是一种妇女绝经后体内雌激素水平下降导致的一种以骨转换增加、骨量丢失为特征的骨代谢性疾病。传统的治疗方法主要为激素替代疗法(HRT)，但是HRT长期应用所产生的不良反应使其应用受到很大限制。而α-玉米赤霉醇(α-ZAL)是一种新型植物雌激素，具有雌激素样作用，而对子宫内膜癌、乳腺癌等发病率无明显影响，甚至对子宫、乳腺具有潜在保护作用。α-ZAL具有改善绝经后OP骨生物力学指标的作用，能对绝经后OP发生产生一定防治作用，但其具体机制还不清楚。本实验拟观察应用α-ZAL治疗后去卵巢大鼠骨组织雌激素受体α和βmRNA的变化，为探讨其防治绝经后OP的机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物 α-ZAL(sigma公司);戊酸雌二醇片为广州仙灵制药公司生产(批号:145A13);Trizol试剂为北京迈晨科技有限公司产品;一步法RT-PCR试剂盒购自北京康为世纪生物公司。大鼠ERα、β和β-actin引物，北京奥科生物公司合成。

1.2 动物分组 6月龄雌性SD大鼠40只，体重250～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:906155。大鼠实验室适应1 w后随机分为空白对照(Sham)组、模型组、雌二醇(OVX+E2)组、α-ZAL组(OVX+α-ZAL)，每组10只。各组大鼠10%水合氯醛腹腔注射(2 ml/kg)麻醉后，下腹正中备皮切口入腹，将卵巢牵拉出腹腔外，除Sham组外，其余各组结扎血管后完整切除双侧卵巢，Sham组开腹后切除卵巢旁一小块脂肪组织，不切除卵巢，然后将腹腔分层缝合。术后给予青霉素20万U肌肉注射抗炎，每天1次，连续3 d。手术后第3周开始灌胃给药，OVX+E2组给予戊酸雌二醇1 mg/kg，OVX+α-ZAL组给予α-ZAL 1 mg/kg，每日1次，Sham组和模型组灌胃相应体积生理盐水，连续灌胃12 w。实验结束时，分离大鼠双侧胫骨，将附着于骨表面的肌肉及结缔组织剔除干净，双侧胫骨放入冻存管中，标记后投入液氮保存。

1.3 各组大鼠骨组织中ERα和 βmRNA表达情况 Trizol一步法提取骨组织总RNA，应用HiFi-MMLV一步法RT-PCR试剂盒扩增 ERs基因片段。ERα上游引物为5'-AATTCTGACAATCGACGCCAG-3'，下游引物为 5'-GTGCTTCAACATTCTCCCTCCTC-3'，扩增产物为345 bp;ERβ的上游引物为5'-TCACCGTCGAGCCTTAGTTC-3'，下游引物为 5'-TCTGCATAGAGGAGCGATGA-3'，扩增产物为286 bp。以β-actin作为内参照，上游引物为5'-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3'，下游引物为5'-GGCAACATAGCACAGCTTCT-3'，扩增产物为216 bp。扩增条件为:45℃反转录30 min;95℃预变性2 min;94℃变性15 s，60℃退火、延伸30 s，30个循环;72℃终延伸5 min。

1.4 RT-PCR产物半定量分析 取10μl PCR产物，加入2μl上样缓冲液，混匀，分别加入样品，在1×TAE缓冲液中60 V电泳1 h，美国Bio-Rad公司凝胶成像仪下观察拍照，扫描后应用Molecular Analyst分析软件，对阳性电泳条带进行吸光度峰值下面积积分，将 ERα(或 ERβ)/β-actin的比值作为 ERα(或ERβ)mRNA表达水平的相对量

1.5 统计学处理 采用SPSS14.0软件，结果以x±s表示，总体进行方差分析，组间比较用LSD法。

2 结果

RT-PCR结果显示大鼠去卵巢后，ERα和βmRNA表达量较Sham组明显降低(P＜0.05)，经雌激素治疗后，ERα和β mRNA出现上调(P＜0.05)，而α-ZAL能上调ERαmRNA水平，对于ERβmRNA与模型组比较无显著差异(表1和图1)。

表1 各组大鼠ERα和ERβmRNA表达情况(x±s)

图1 各组大鼠胫骨ERα和βmRNA表达电泳结果

3 讨论

雌激素是通过与其受体ER结合发挥作用的，ER属于核受体超家族成员，主要包括两种亚型:ERα和β，ERα是在1986年首先被克隆，随后ERβ在1996年被克隆出来。ERs属于甾体激素受体超家族，ERα和β结构相似，因此其在功能上也有相似性。两种ER在组织中分布不同，ERα主要存在于子宫和乳腺，而ERβ主要存在于中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、骨、肾、肺等。ERs在骨骼细胞的密度极低，因此一直以来认为雌激素对骨的作用是间接产生的，但随着ERs在骨骼细胞的发现，人们逐渐认识到骨骼是雌激素直接作用的靶器官，ERs在骨骼细胞上的表达与骨量增长和维持有密切关系。雌激素可以与骨骼细胞上ERs特异性结合，调节成骨细胞和破骨细胞活动，介导雌激素和骨吸收、骨形成之间的联系，从而对骨代谢起重要调控作用。因而，ERs是调控骨吸收和骨形成的重要枢纽，也是绝经后OP形成的重要枢纽。因此，研究ERs在OP发生过程中的作用及其变化对于更好地探明绝经后OP的发病和药物防治绝经后OP的机制更为重要。虽然ERα和β结构相似，但其在调节骨代谢过程中扮演了不同的角色，两者在空间分布和表达数量上也存在一定差异。Onoe等〔1〕发现原代大鼠成骨细胞的ERβmRNA水平明显高于ERαmRNA，同时还发现，ERβmRNA在松质骨中的表达水平高于皮质骨，这解释了绝经后小梁骨的受累程度较皮质骨严重而容易骨折的原因。ERα和β对骨代谢的作用还存在一定差异。应用基因敲除技术研究发现，ERα和β虽然共同参与雌激素的骨保护效应，但这种效应主要是由ERα介导的。本实验结果显示骨组织细胞中ERβmRNA的表达较ERα高，与上述结果一致。

ERs主要存在于成骨细胞和生长板的软骨细胞，而破骨细胞和骨细胞中的表达水平较低。而且，随着骨龄的增长和骨细胞发育分化，ERs表达水平也呈现一定动态变化。Lanyon等〔2〕发现，随着增龄，骨细胞上的ERs密度逐渐减少。Onoe等还发现，随着成骨细胞的分化成熟，ERβmRNA表达呈现持续性高表达，而ERαmRNA表达则呈现逐渐上升趋势。

骨组织中ERs表达还与体内雌激素水平具有相关性，成骨细胞的分化程度及外界影响都可以改变ERs密度和两种亚型比例〔3〕，刘博等〔4〕通过对不同月龄雌性大鼠成骨细胞中 ERα表达研究发现，ERα密度随着月龄的改变和体内雌激素变化而呈现规律性变化。ERα和β表达水平与体内雌激素水平一致，并且雌激素受体表达有赖于体内雌激素的存在，雌激素水平降低后可使雌激素受体表达减少。因此，妇女绝经后由于体内雌激素水平下降，可以引起骨组织ERs表达水平下降，从而使雌激素对骨的作用减弱，成骨细胞凋亡增加，骨形成受到抑制，导致绝经后OP。研究发现，绝经后骨量减少，可能与骨骼细胞中缺乏ERα有关。骨组织细胞中ERs密度可以决定OP发病以及疾病严重程度，ERs表达水平越低，OP也就越严重。应用雌激素治疗后，骨骼细胞内ERs mRNA表达出现上调，使雌激素对骨骼细胞的作用增强，从而产生防治OP的作用。

本研究结果提示α-ZAL具有与雌激素类似的作用，也可以调节ERαmRNA的表达而对绝经后OP产生治疗作用，这可能是其防治绝经后OP的作用机制之一。但由于α-ZAL雌激素作用较弱，对ERβmRNA表达无明显影响。

1 Onoe Y，Miyaura C，Ohta H，et al.Expression of estrogen receptor beta in rat bone〔J〕.Endocrinology，1997;138:4509-12.

2 Lanyon L，Armstrong V，Ong D，et al.Is estrogen receptorα key to controlling bone's resistance to fracture〔J〕.J Endocrinol，2004;182(2):183-91.

3 Waters KM，Rickard DJ，Riggs BL，et al.Estrogen regulation of human osteoblast function is determined by the stage of differentiation and the estrogen receptor isoform〔J〕.JCell Biochem，2001;83(3):448-62.

4 刘 博，陶树清，尹文哲.雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体表达的研究〔J〕.哈尔滨医科大学学报，2004;38(2):179-81.