张雪玲 齐晓岚 单可人 官志忠

(贵阳医学院分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

阿尔茨海默病(AD)又称老年性痴呆，是一种主要在老年期发生的以认知能力缓慢性进行性丧失为主要特征的神经退变性疾病。病理学上以细胞外老年斑(SPs)形成及神经细胞内神经原纤维缠结(NFTs)为主要特征〔1～3〕。SPs的主要成分为β-淀粉样蛋白(Aβ)，是一种神经毒性物质，可以引起神经元的损伤和死亡，在 AD的发病中起着重要的作用。β-分泌酶(BACE)是启动Aβ形成的关键限速酶。因此，BACE有望成为治疗AD的作用靶点，为开发治疗AD的提供了一条新思路〔4〕。神经型尼古丁受体(nAChR)与大脑学习记忆、智力发育和识别能力等脑功能有关，还具有明显的神经保护作用〔5〕，在AD的发病中起着重要的作用。本课题组前期研究表明α3 nAChR具有一定的对抗Aβ的神经毒性作用，在AD的发病机制中具有重要作用〔6〕，但其具体机制是否与Aβ生成密切相关的BACE有关，有待进一步研究。本研究观察α3 nAChR是否通过影响BACE蛋白表达从而减少Aβ的神经毒性作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及设备 D-MEM培养液购自Gibco Invitrogen公司(英国);G418购自Sigma公司;普通化学试剂均购自Sigma公司;源于人脑的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)购于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司(德国);稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒及空质粒的SH-SY5Y神经细胞本课题组于2008年冻存于本实验室液氮罐中;羊抗BACE1及BACE2、鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz公司(美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞为贴壁细胞。用含15%小牛血清、双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)的DMEM作为培养基，转染 α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo质粒的实验组与转染空质粒Negative control pSilencer 3.1-H1 neo的空质粒对照组，还需用含 0.4 mg/ml G418的培养液筛选，5%CO2、37℃恒温培养。

1.2.2 SH-SY5Y细胞α3 nAChR基因沉默效果测定 采用Trizol(Invitrogen)一步法提取细胞总RNA。将mRNA逆转录反应成cDNA。以逆转录产物为模板进行Real-time PCR。所用试剂为 TaqMan Universal 2 ×PCR Mix，α3 nAChR(Hs01088199_m1)和内对照β-actin(4352935E)Taqman探针购自Applied Biosystems公司，ABI7300型荧光定量PCR仪采集待测基因及内参照 β-actin扩增各循环荧光信号，以 Applied Biosystems SDS1.4软件进行荧光采集和数据分析。SDS1.4软件分析其△△Ct值及 RQ(relative quantity)值，RQ=2-△△Ct。分析实验结果时以β-actin为内对照，计算转染α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo质粒的实验组与正常对照组及空质粒对照组间α3 nAChR mRNA和对照组的相对水平。用蛋白印迹方法检测α3 nAChR蛋白表达水平。重复三次。

1.2.3 BACE蛋白表达水平测定 参照Guan等〔7〕的方法进行提取细胞蛋白并定量，加磷酸盐缓冲液(PBS，4℃预冷)洗涤一次后用细胞刮收集细胞入1.5 ml无菌离心管中，再用PBS洗涤一次加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)和复合蛋白酶抑制剂的细胞裂解液约40～60μl，置于冰上1 h，其间不时置于漩涡混匀器，使细胞充分裂解;12 000 r/min，4℃，离心40 min;小心吸取上清液至另一发泡聚丙烯(EPP)管;对上述制备的上清液进行蛋白定量后分装，－20℃保存备用;用蛋白印迹方法检测BACE1，BACE2蛋白表达水平。实验重复三次。

1.3 统计学分析 应用 SPSS 14.0统计软件进行分析，所得结果用x±s表示，两因素析采用方差分析。

2 结果

2.1 稳定转染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo质粒细胞株mRNA及蛋白表达水平 用Real-time RT-PCR及Western印迹方法检测到SH-SY5Y细胞转染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo质粒后mRNA和蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)，而转染空质粒与正常对照组相比差异无显著性。见表1，图1。

图1 稳定转染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo质粒细胞株α3 nAChR蛋白表达

2.2 α3 nAChR基因表达沉默对SH-SY5Y细胞BACE蛋白表达水平的影响 SH-SY5Y细胞α3 nAChR基因表达沉默后，细胞BACE 1蛋白表达水平明显增高(P＜0.01)，BACE 2蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)。见表2，图2。

图2 稳定转染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo质粒细胞株BACE1及BACE2蛋白表达

表1 稳定转染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo质粒细胞株α3 nAChR mRNA及蛋白表达(x ± s，n=3)

表2 稳定转染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo质粒细胞株BACE1、BACE2蛋白表达水平(x ± s，n=3)

3 讨论

nAChR是一类明确的具有神经保护功能的受体，与大脑学习记忆、智力发育和识别能力等脑功能有关，还调节多种受体的功能，并具有对抗细胞毒性神经保护作用，其含量减少与AD的发生有关，在SH-SY5Y神经细胞中α3是主要的尼古丁受体亚类之一，与AD的发病有关。但α3 nAChR对与Aβ生成密切相关的BACE的蛋白表达的影响尚未见报道。Aβ是由其APP经β-和γ-分泌酶水解后而形成，具有一定的神经毒性作用，可以引起神经元的损伤和死亡，只有完整的Aβ才能发挥神经毒性作用。BACE是启动Aβ形成的关键限速酶，有两个亚型即BACE1和BACE2。BACE1是具有BACE活性的天门冬氨酸蛋白酶，俗称BACE1或BACE。研究表明纯化的BACE1蛋白的确在BACE的作用位点进行切割〔8〕，从而增加神经毒性物质Aβ的生成。在发现 BACE1不久，发现了其同源蛋白称为BACE2。研究表明，BACE2虽能在BACE位点裂解APP，但它在Aβ结构域内部的裂解更有效，因此BACE2可抑制神经毒性物质的Aβ生成〔9〕。本课题组前期研究显示α3 nAChR具有一定对抗Aβ的神经毒性作用，其是否与β分泌酶有关未见报道。本课题组构建了SH-SY5Y细胞α3 nAChR siRNA真核表达载体，并且有效地表达了针对α3 nAChR的siRNA，将其转染至SH-SY5Y细胞，采用实时荧光定量(RT-PCR)和蛋白印迹方法分别对α3尼古丁受体基因mRNA和蛋白水平进行了分析。结果表明，由siRNA介导沉默后α3尼古丁受体基因的表达及蛋白的表达均明显下降，且下降程度基本一致。结果表明小分子干扰RNA能有效地抑制内源性α3 nAChR基因的表达。本研究结果显示稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒的细胞克隆株，与空质粒及正常对照组相比BACE1蛋白表达水平增加，BACE2蛋白表达水平减少，表明α3 nAChR能够增加BACE2蛋白表达水平及减少BACE1蛋白表达水平而影响Aβ的生成从而对抗Aβ的神经毒性作用，发挥神经保护作用。

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2 Doody RS，Stevens JC，Beck C.Practice parameter:management of demen-tia(an evidence-based review)〔J〕.Neurology，2001;56(9):1154-66.

3 Paterson D，Nordberg A.Neuronal nicotinic receptors in the human brain〔J〕.Prog Neurobiol，2000;61(1):75-111.

4 Hong L，Turner RT，Koelsch G，et al.Memapsin 2(beta-secretase)as a therapeutic targe〔tJ〕.Biochem Soc Trans，2002;30(4):530-4.

5 Kihara T，Shiohama S，Sawasa H，et al.Nicotinic receptor stimulation protects neurons against β-amyloid toxity〔J〕.Ann Neurol，1997;42(2):159-63.

6 唐 智，齐晓岚，单可人，等.SH-SY5Y神经细胞中尼古丁受体α3亚单位基因表达抑制与APP代谢的关系〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(21):2749-51.

7 Guan ZZ，Miao H，Tian JY，et al.Suppressed expression of nicotinic acetylcholine receptors by nanomolar beta-amyloid peptides in PC12 cells〔J〕.J Neural Transm，2001;108(12):1417-33.

8 Vassar R，Bennett BD，Babu-Khan S，et al.Beta-secretase cleavage of Alzheimers amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE〔J〕.Science，1999;286(5440):735-41.

9 Vassar R，Citron M.Aβ-generating enzymes:recent advances inβ-andγsecretase research〔J〕.Neuron，2000;27(3):419-22.