宋新宇 陈世雄 曾凡军 高宝安 杨卫兵

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院呼吸内科，湖北 宜昌 443003)

HLA-G在肿瘤中的免疫抑制功能越来越受到关注。在恶性黑色素瘤〔1〕，肾细胞癌〔2〕，肺癌〔3〕，卵巢癌、乳腺癌〔4〕和神经胶质瘤中〔5〕均发现HLA-G蛋白的表达。HLA-G可阻止自然杀伤(NK)细胞的细胞溶解活性，诱导CD8+细胞毒性T细胞的凋亡和CD4+T细胞的同种增殖反应〔6〕。除这些细胞间的相互作用外，HLA-G还可通过调节细胞因子的释放及促进辅助性T细胞比值(Th1/Th2)平衡向Th2方向的漂移来抑制免疫系统〔7〕。有报道显示，Th2细胞因子中的IL-10诱导了HLA-G的表达，同时HLA-G似乎又反向刺激IL-10的表达〔8〕。而肿瘤细胞则可能通过该途径对抗那些聚集到其周围的免疫细胞〔9〕。本研究将探讨HLA-G与IL-10在非小细胞肺癌标本中的表达及两者的相关性。

1 材料与方法

1.1 患者和组织学标本 通过外科切除的方式获得38例肺癌标本，这些患者术前均未接受放、化疗。在切除肿瘤的同时获取10例正常肺组织标本作为对照。这38位患者均来源于2007年5月至2008年6月间在华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科住院患者，年龄32～75(平均62±12)岁，其中男27例，女11例。组织病理学分型:腺癌18例，鳞癌12例，大细胞癌8例。病理学分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例。所有组织标本被冰冻保存于－80℃。

1.2 RNA提取与cDNA合成 用RNA提取试剂盒(Invitrogen，USA)按照其说明书从冰冻组织样本中提取总RNA。取1μg总RNA逆转录成cDNA存放于－20℃直到使用时。

1.3 实时定量PCR检测HLA-G、IL-10 mRNA表达 用荧光实时定量PCR(Rotor-Gene RG-3000;Cobett Company，Australia)扩增目标cDNA序列。HLA-G和IL-10 PCR特异性扩增引物序列如下:HLA-G正义链5-CTGGAGAACGGGAAGGAGAT-3;反义链5-GGGTGGCCTCATAGTCAAAG-3。IL-10正义链5-ATGCACAGCTCAGCACTGC-3;反义链5-TCAGTTTCGTATCTTCATTGTC-3。β-actin正义链5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3';反义链5'-TCCTTAATGTCACGCAGATTT-3'。

1.4 免疫组化法检测HLA-G、IL-10蛋白表达 免疫组化反应中所用的抗体:抗人HLA-G单克隆抗体4H84(Santa Cruz，USA)，兔抗人IL-10多克隆抗体(BOSTER，CHINA)。以IL-10和HLA-G的染色阳性细胞数占细胞总数的百分比作为其标记指数。至少在4个视野进行细胞计数(200倍显微镜视野下)。

1.5 统计学分析 运用SPSS13.0统计软件，正态资料用x±s表示，定性资料的统计用fisher精确概率法;定量资料的统计用t检验或方差分析，两因素相关性分析用Spearman等级相关。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌和正常肺组织中HLA-G、IL-10蛋白的表达38例肺癌标本中有21例(55.3%)HLA-G蛋白表达阳性，有23例(60.5%)IL-10表达阳性。而正常肺组织中没有检测到HLA-G和IL-10的蛋白表达。见图1。

图1 HLA-G和IL-10蛋白在肺癌组织中的表达(×200)

2.2 非小细胞肺癌和正常肺组织中HLA-G、IL-10 mRNA的表达 正常肺组织标本，均无HLA-G和IL-10 mRNA的表达。肺癌组织中HLA-G和IL-10 mRNA的表达量(2-△△Ct)分别是正常组织的 12.3倍(12.26±7.84，t=4.51，P＜0.01)和11.7倍(11.66 ±4.79，t=6.98，P ＜0.01)。

2.3 非小细胞肺癌中HLA-G和IL-10表达之间的关系 21例HLA-G蛋白表达阳性的肺癌标本中，有12例IL-10表达阳性，9例IL-10表达阴性，Spearman相关分析示，两者在蛋白表达水平无明显相关(r=－0.077，P=0.646)。两者在mRNA水平也没有明显相关性(r=0.006，P=0.969)。

2.4 HLA-G与患者临床病理因素的相关性 非小细胞肺癌HLA-G mRNA和蛋白表达均与肺癌TNM分期成正相关(r=0.913，P ＜0.001;r=0.429，P=0.007)，晚期非小细胞肺癌HLA-G的表达是增高的。除此之外，未发现其他临床病理因素与HLA-G的表达相关。见表1。

表1 HLA-G mRNA和蛋白表达水平与肺癌患者临床病理因素之间的关系

3 讨论

虽然在肿瘤患者中，Th2细胞因子(IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)与肿瘤发展之间的临床关系未被完全阐释清楚，但目前认为机体抗肿瘤免疫系统的损害与细胞因子平衡向Th2方向系统性转移有关。IL-10作为一种重要的Th2类细胞因子，可表达于不同肿瘤细胞中〔10〕。此外，IL-10作为一种重要的免疫抑制因子，其在创造有助于肿瘤生存的免疫抑制微环境中发挥着多种生物学效应。Moreau等人研究结果显示，在单核细胞中IL-10诱导HLA-G的表达可能起着下调免疫反应的作用〔8〕。同时Singer等也发现IL-10阳性细胞经常位于HLA-G阳性细胞周围，HLA-G可能诱导了IL-10的表达〔4〕。先前也有研究表明，HLA-G能调节Th1/Th2细胞因子平衡朝Th2方向偏移，HLA-G被认为具有免疫调节作用〔11〕。由此推测，在肿瘤的发展过程中，HLA-G和IL-10可能通过相互调节而促进恶性肿瘤的转移。

本研究发现在mRNA和蛋白水平HLA-G的表达与IL-10无相关性。由此推测，IL-10的表达可能是膜型HLA-G及其他多种因素共同作用的结果。已有相关研究显示，无论是否有膜型HLA-G表达细胞的存在，可溶性HLA-G都可通过单个核细胞从另一方面增加 IL-10的产物〔12〕，且释放入血的可溶性HLA-G可通过诱导T细胞凋亡〔13〕或诱导IL-10的产生〔14〕促使系统免疫无应答。所以肺癌中可溶性HLA-G与IL-10的关系有待进一步研究。此外，分析表明HLA-G mRNA和蛋白表达均与肺癌TNM分期呈正相关。晚期肺癌患者肿瘤细胞中HLA-G的表达较早期患者增高。这一结果提示，HLA-G可能在肺癌进展中起重要作用，并可能成为评估肺癌预后的指标。

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7 Kanai T，Fujii T，Kozuma S，et al.A subclass of soluble HLA-G1 modulates the release of cytokines from mononuclear cells present in the decidua additively to membrane-bound HLA-G1〔J〕.J Reprod Immunol，2003;60(2):85-96.

8 Moreau P，Adrian-Cabestre F，Menier C，et al.IL-10 selectively induces HLA-G expression in human trophoblasts and monocytes〔J〕.Int Immunol，1999;11(5):803-11.

9 Urosevic M，Dummer R.HLA-G and IL-10 expression in human cancerdifferent stories with the same message〔J〕.Semin Cancer Biol，2003;13(5):337-42.

10 Khong HT，Restifo NP.Natural selection of tumor variants in the generation of“tumor escape”phenotypes〔J〕.Nat Immunol，2002;3(11):999-1005.

11 Kanai T，Fujii T，Unno N，et al.Human leukocyte antigen-G-expressing cells differently modulate the releaseof cytokines from mononuclear cells present in the decidua versus peripheral blood〔J〕.Am JReprod Immunol，2001;45(2):94-9.

12 Kanai T，Fujii T，Kozuma S，et al.Soluble HLA-G influences the release of cytokines from allogeneic peripheral blood mononuclear cells in culture〔J〕.Mol Hum Reprod，2001;7(2)195-200.

13 Fournel S，Aguerre-Girr M，Huc X，et al.Cutting edge:soluble HLA-G1 triggers CD95/CD95 ligand-mediated apoptosis in activated CD8+cells by interacting with CD8〔J〕.J Immunol，2000;164(12):6100-4.

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