吴安国，曾 宝，2，王春玲，陈建南，赖小平，2

(1.广州中医药大学新药开发研究中心，广东广州 510006;2.东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东东莞 523808)

黄连习称“味连”、“雅连”、“云连”。3种黄连均含有多种生物碱，其中主要生物碱为小檗碱(berberine)。其具有广谱抗生素的作用，在临床上长期以来用于降热镇痛、抗肠道细菌感染，近年来发现黄连还具有抗癌［1－2］、抗放射及促进细胞代谢、抗心律失常、调血脂［3］、抗糖尿病肾病［4］、预防骨质疏松症［5］、降血糖、抗血小板聚集等药理作用。Sakuri等［6］利用同位素标记的方法对大鼠口服小檗碱后进行研究，结果表明小檗碱在胃肠道吸收不好;而且也有黄连素给狗口服吸收较差的报道［7］。Caco-2模型作为研究药物体外吸收与转运的有效工具能够有效地预测药物在体内的吸收与转运情况。本实验将系统考察小檗碱在Caco-2模型中的转运，同时比较小檗碱单体与黄连提取物中的小檗碱转运的差异，在此基础上进一步探讨影响中药提取物在体内吸收与转运的因素。

1 仪器与材料

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津);电子天平(十万分之一)(D2251，广州市正一科技有限公司);CO2培养箱(CO-150，北京五洲东方科技发展有限公司);双人单面净化工作台(SW-CJ-2JD，苏州净化设备有限公司);倒置显微镜(OlympusIX2-SP，日本);细胞电阻仪(Millicell-ERS，美国)。Caco-2细胞株(中科院上海细胞库，细胞代数:40～50)，小檗碱(批号110713-200609，购于中国药品生物制品检定所);甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克公司);12孔Transwell培养板、75 cm2培养瓶〔购自Corning-Costar(Cambridge，MA，USA)〕公司;DMEM 培养基(Dulbecco's Modifled Eagle's Medium，Gibco)HBSS(实验室配制)。

2 方法

2.1样品的配制

2.1.1储备液的配制精密称取小檗碱对照品适量，加HBSS溶解并定容至10 ml，摩尔浓度为1 mmol·L－1，作为小檗碱储备液。

2.1.2维拉帕米溶液的配制精密称取维拉帕米适量，加甲醇溶解并定容至10 ml，摩尔浓度为20 mmol·L－1，精密吸取维拉帕米甲醇溶液适量，用pH=7.4的HBSS定容至50 ml的容量瓶中，最终浓度为 200 μmol·L－1，作为维拉帕米储备液。

2.1.3小檗碱HBSS样品的配制精密吸取储备液适量，加pH=7.4的HBSS定容至刻度，配制成10、20、50、80、100、150、200、300、400μmol·L－1不同浓度的样品。

Fig 1 HPLC chromatograms of blank Hanks buffer solution(HBSS)(A)，blank HBSS with bererine(B)and sample(C)

2.1.4含维拉帕米的样品溶液精密吸取维拉帕米储备液5 ml、不同体积的小檗碱储备液置10 ml的容量瓶中，加pH=7.4的HBSS定容至10 ml。

2.1.5不同pH的小檗碱溶液的配制将 pH=7.4的HBSS溶液用HCl和NaOH溶液分别调节pH为5和9，按照“2.1.3”项的样品配制法配制不同pH的样品。

2.1.6黄连提取物中不同浓度的小檗碱溶液的配制称取适量药材，用10、8、6倍量的水分别提取3次，每次1 h，合并提取液，过滤，浓缩至干，加HBSS溶解，应用 HPLC 定量至 50 μmol·L－1。

2.2细胞毒性试验将Caco-2细胞悬液接种于灭菌处理的96孔板中，每孔加100 μl，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，然后加入样品溶液，并设对照孔，孵育4 h后吸出溶液加入MTT，再培养4 h，吸掉上清液，加入DMSO，用酶标仪测定每孔值。记录结果，得到细胞的安全浓度。

2.3双向转运实验待Transwell板培养至d 21，各份溶液除菌后，用预热的pH 7.4的HBSS洗生长有Caco-2的Transwell板两次。对于从AP侧到BL侧的转运:将0.5 ml的样品溶液加到AP侧作为供给池，在BL侧加入1.5 ml空白的HBSS作为接受池;对于从BL侧到AP侧转运:将1.5 ml样品液加到BL侧作为供给池，0.5 ml空白的HBSS加到AP侧作为接受池，把Transwell培养板置于37℃，5%CO2的培养箱中，分别在 30、60、90、120 min 吸取接收室的转运液0.5 ml(AP→BL)、0.25 ml(BL→AP)，同时补加相应37℃空白pH 7.4的HBSS液，冷藏备用。

2.4分析方法的建立

2.4.1色谱条件色谱柱:Kromasil 100-5 C18(250 mm ×4.5 mm，5 μm)，流动相:乙腈 ∶0.3% 磷酸溶液(三乙胺调节pH为4)=35∶65，流速为1 ml·min－1，柱温:25 ℃，检测波长265 nm

2.4.2样品处理取样品溶液8 000 r·min－1离心10 min，吸取上清液，进样。

2.4.3标准曲线的建立精密量取储备液适量，按照“2.1.3”样品配制方法配成摩尔浓度为200、100、80、40、20、2 μmol·L－1的一系列摩尔浓度，样品溶液按“2.4.2样品处理”项操作后进样。结果标准曲线Y=13256X－1321.7(r=0.999 9)。HPLC图谱见Fig 1。

2.4.4精密度和稳定性考察小檗碱200、100、50 μmol·L－1高、中、低3个不同浓度的精密度和稳定性，3个不同浓度的精密度的 RSD值分别为0.10%、0.20%、1.45%，稳定性的 RSD值分别为0.26%、0.10%、0.41%，表明此方法适合于小檗碱的含量测定。

2.5计算Papp值药物透过Caco-2细胞单层的表观穿透系数用Papp值作为参考，计算下式:Papp=dQ/(dt·A·C0)cm/s。其中dQ(nmol)为dt(s)内的转运量，(cm2)为膜面积，C0(nmol·L－1)为在 Caco-2单层细胞的顶侧或肠腔侧的药物初浓度。两侧转运率比值Pratio的计算公式:Pratio=Papp，(BL→AP)/Papp，(AP→BL)。其中Papp，(BL→AP)和Papp，(AP→BL)分别为双向表观渗透系数。

3 结果

3.1小檗碱单体跨膜转运

3.1.1时间及浓度对小檗碱转运的影响从Fig 2，3中可以看出在相同浓度条件下，小檗碱的双向转运量呈增长趋势;Fig 4中小檗碱的转运速率随浓度而增加，说明其转运速率主要受浓度驱使;小檗碱在BL→AP方向的转运量要远远大于AP→BL方向的转运量，说明小檗碱的转运有一定的方向性;小檗碱的Pratio值随浓度的增加而提高(Tab 1)。综合上述结果说明小檗碱在AP→BL方向的转运方式可能以被动转运为主，BL→AP方向的转运方式可能是有载体参与的主动转运。

Tab 1 Effects of concentration on the Pappof berberine

3.1.2抑制剂维拉帕米对小檗碱转运的影响从Tab 2可以看出维拉帕米对小檗碱AP→BL方向的转运量没有明显影响，但是可以明显减少BL→AP方向的转运量，说明小檗碱可能受到P-gp的调控作用。

Fig 2 Effects of the time on the transport of berberine(AP→BL)

Fig 3 Effects of the time on the transport of berberine(BL→AP)

Fig 4 Transport rate of berberine with different concentrations(AP→BL)

Tab 2 Effects of verapamil on the Pappof berberine

3.1.3温度对小檗碱转运的影响由于温度主要影响转运蛋白的活性，同时影响药物在溶剂的状态(小檗碱在低温时的溶解度减少)，因此对药物在Caco-2细胞膜上的转运产生重要影响。从Tab 3可以看出在4℃时，小檗碱在BL→AP方向的转运量急剧下降，其Papp值从(111.20±2.72)×10－7减少到(12.72±0.60)×10－7。说明小檗碱在 BL→AP方向的转运以主动转运为主。

Tab 3 Effects of temperature on the Pappof berberine

3.1.4pH对小檗碱转运的影响从Tab 4可以看出小檗碱在偏酸的HBSS中的转运量最高，小檗碱属于生物碱类，这结果可能与小檗碱的性质有关。

Tab 4 Effects of pH on the Papp(AP→BL)of berberine

Tab 5 Pappvalue of berberine as single compound and that of berberine being in extract

3.2黄连提取物中的小檗碱跨膜转运实验同时比较了小檗碱单体与黄连提取物中的小檗碱的跨膜转运，小檗碱的摩尔浓度均为50 μmol·L－1，从 Tab 5中可以看出小檗碱在AP→BL和BL→AP方向的Papp值都明显减少，说明黄连提取物中的其他生物碱与小檗碱竞争转运，在AP→BL方向可能是对转运通道的竞争转运，在BL→AP方向则主要对转运蛋白的竞争转运。

4 讨论

Caco-2细胞来源于人类结肠癌细胞，其结构和生化特点类似于人类小肠上皮细胞，含有与小肠刷状缘上皮相关的酶，能够在细胞水平提供关于药物分子通过小肠黏膜的吸收、代谢、转运信息［8］。许多研究表明［9－10］，细胞模型与整体吸收有良好的相关性。是研究药物吸收机制，预测口服药物体内吸收、生物利用度、安全性以及新药剂型设计的良好工具。为验证实验结果的准确性还需进一步与整体动物实验数据相结合，为新剂型的设计提供理论依据。

本实验在系统考察小檗碱在Caco-2的转运方式的同时比较了小檗碱单体与黄连提取物中小檗碱的转运的差异，表明了中药提取物中化学成分的复杂多样化使得影响小檗碱的转运的因素也多样化，出现了中药提取物中的化学成分在Caco-2模型中的转运跟中药配伍一样有相互促进或者相互抑制现象，对于应用Caco-2模型来探讨中药提取物在体外的吸收转运有待进一步的研究。

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