任美英,周 媛,陈 沫

(解放军208医院 1.急诊科;2.妇产科;3.461医学部,吉林 长春130062)

我国围产医学的不断发展带来了围产儿死亡率的下降,但这却使先天畸形所造成的围产儿死亡在总围产儿死亡比率中不断上升[1]。先天神经管缺陷是由于神经管的发生和分化紊乱而出现的。是人类出生缺陷中最常见且最严重的一组畸形。包括无脑儿、脑膜膨出、脑膨出、脑积水、脊髓及脊膜膨出、脊柱裂等不同的临床类型[2]。先天神经管缺陷在世界各地均有发生,我国属高发地区,2000年11月中国出生缺陷报告示围产儿的发生率平均为0.247%。先天神经管缺陷的后果极为严重,可导致自然流产、死胎、死产及新生儿死亡。但到目前为止其发病的明确原因还没有被阐明。一般认为此病是环境因素和遗传因素共同作用的结果,目前研究的热点是同型半胱氨酸代谢相关因素与先天神经管缺陷发病的相关性。本实验是针对同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)的基因多态性与先天神经管缺陷的关系进行的研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象 先天神经管缺陷组来自解放军208医院及解放军第208医院461医学部,为2001年1月至2010年1月期间诊断为先天神经管缺陷并引产的胎儿及诊断为先天神经管缺陷的新生儿共82例。男42例,女40例。其中引产胎儿64例,胎龄最小者为20周。对照组为同期就诊于上述医院的健康计划外妊娠引产的胎儿及新生儿180例,男女比例、引产胎儿所占比例及引产胎儿胎龄均与疾病组相匹配。疾病组中只有一种先天神经管缺陷的胎儿、新生儿为单一畸形组,有两种或两种以上的先天神经管缺陷的多畸形组,畸形分组只考虑神经管缺陷,其他器官系统畸形不在分组考虑之列。全部实验对象相互间无血缘关系,且双亲均为汉族。

1.2 模板DNA的制备 所有引产胎儿均于胎心尚未停止时破膜并采胎儿头皮血或脐带血3 ml,新生儿采脐静脉血3 ml,用EDTA-K2抗凝,采用已建立的碘化钠裂解、氯仿及戊醇提取法[3]提取白细胞基因组DNA,-30℃保存备用。

1.3 引物合成(由上海生物工程有限公司合成)参照文献[4]设计一对引物,扩增MTRR基因第66位点区的一段DNA序列。上游引物:5′-CAGGCAAAGGCCATCGCAG AAGACAT-3′,下 游引 物:5′-CACTTCCCAACCAACCAAAATTCTTCAAAG-3′。

1.4 扩增条件 PCR反应体系为25 μ l,其中模板DNA100 ng,10×PCR缓冲液2.5 μ l,Taq酶(德国QIAGEN公司产品)2.5 U,10 mmol/L三磷酸脱氧核苷(dNTPs)0.5 μ l,上、下游引物各 1 μ l。PCR 反应条件为:94℃预变性 10 min,然后 95℃30 s,57℃45 s,72℃45 s,35个循环后,72℃延伸7 min。4℃保存。

1.5 扩增产物的限制性酶切 取PCR扩增产物10 μ l,用8U NadeⅠ限制性内切酶于37℃酶切16 h。反应终止后,产物经3%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,染色后以DL 200 bp DNA片段长度标准物为参考,在紫外灯下判断结果,并拍照。

1.6 统计学处理 用基因直接计数法计算两组人群的基因型及等位基因频率,不同人群间基因型及等位基因频率用 χ2检验,均在SPSS 13.0软件包上完成。以P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 MTRR基因型分析 MTRR基因66位点多态性,PCR扩增产物片段大小为151 bp,根据限制性内切酶NadeⅠ酶切片段的情况,基因型有三种,AA型(124 bp,27 bp,2条带),AG型(124 bp,151 bp,27 bp,3条带)GG型(151 bp,1条带),根据所获条带数目可直接判断出基因型。

2.2 疾病与对照两组人群MTRR的66位点A/G携带频率比较

(1)疾病与对照两组人群MTRR的66位点A/G的分布频率有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

表1 疾病组与对照组MTRR的第66位点A/G携带频率分布

(2)单一畸形与两种和两种以上畸形两组人群MTRR的 66位点 A/G携带频率比较:两组人群MTRR的66位点A/G在单畸形组与多畸形组的分布频率无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表2 单、多畸形两组人群间MTRR的第66位点A/G携带频率分布

3 讨论

胎儿血液循环约于受精后3周末建立,妊娠8周以后,胎儿循环血中出现粒细胞,于妊娠12周时胎儿血液中出现淋巴细胞。这些有核细胞均可做为胎儿基因的检测原材料,本实验对象中胎儿的胎龄均在20周以上,目的是确保胎血中的白细胞含量达到可以检测出基因多态性的水平。此外,达一定胎龄以上的引产儿采血更为简便易行。

同型半胱氨酸是甲硫氨酸的主要代谢产物,近年国内已有多项研究证明孕妇高血浆高同型半胱氨酸血症与胎儿先天神经管缺陷的发病有一定程度的相关性[5],这可能与同型半胱氨酸可引起氧化损伤及脂质过氧化等有关[6]。作为体内甲硫氨酸循环的中间代谢产物,同型半胱氨酸将含硫氨基酸,还原型叶酸,维生素B6、维生素B12关联起来。成为重要的代谢中间产物。同型半胱氨酸在先天神经管缺陷的发病过程中同时具有细胞毒性和基因毒性作用,它在代谢过程中可使巯基氧化,产生大量的氧自由基,引起细胞死亡。进而引起胎儿先天神经管缺陷。

再甲基化途径是同型半胱氨酸在细胞内的主要代谢途径之一。同型半胱氨酸重新甲基化为蛋氨酸。由蛋氨酸合成酶催化,VitB12为辅酶,此时同型半胱氨酸与5-甲基四氢叶酸合成蛋氨酸和四氢叶酸。同型半胱氨酸再甲基化反应中,钴胺素作为5-甲基四氢叶酸和同型半胱氨酸之间的中介甲基载体与蛋氨酸合成酶结合在一起。钴胺素辅酶在钴胺素(Ⅰ)和甲基钴胺素(Ⅲ)之间循环。钴胺素(Ⅰ)是强还原剂,可被氧化为钴胺素(Ⅱ)而失活。要使其复活,钴胺素(Ⅱ)必须在S-腺苷甲硫氨酸作甲基供体情况下,由MTRR催化将其还原为甲基钻胺素(Ⅲ),此循环为蛋氨酸合成酶还原系统 。也就是说蛋氨酸合成酶、MTRR是参与该反应的重要酶,在这个反应链条中任何一个环节上的差误都会引发同型半胱氨酸代谢的障碍,进而引发高同型半胱氨酸血症。

MTRR基因定位于5p15.2-15.3,MTRR基因编码的MTRR主要功能是维持足够的活化形式的钴胺素,后者是蛋氨酸合成酶的辅酶[7]。MTRR在维持钴胺素的活化形式上起着关键作用,是血浆同型半胱氨酸浓度的重要决定因子。从同型半胱氨酸的反应链条可以看出,MTRR是一个独立于叶酸、维生素B6及维生素 B12以外的因素,也就是说,由MTRR基因因素而引发的先天神经管缺陷是不可能通过如上所述的维生素类的补给起到预防作用的,可见有针对性的对MTRR基因的研究对于先天神经管缺陷的研究是相当有价值的。

MTRR基因的66A/G是一种错义多态性,此突变可导致高度保守的蛋氨酸转变成异亮氨酸(Va1),已有研究证明这种变化可使MTRR活性下降[8],进而影响同型半胱氨酸代谢。这会使血浆同型半胱氨酸水平增高,大大增加了先天神经管缺陷发生的危险性。

随后几年的研究发现MTRR基因的66位点变异在在先天神经管缺陷患儿及其母亲的发生频率较对照组儿童及其母亲显著增高。也有学者报道先天神经管缺陷患儿MTRR的66位点的突变频率在不同种族,不同地域与对照组比较并不一定显著增高[9,10]。基于如上争议,我们将此项研究进行了多年,我们所得的结论是此基因位点的变异与先天神经管缺陷的发病具有一定程度的相关性。MTRR基因是近年来研究较多的与同型半胱氨酸代谢相关基因之一。迄今为止共报道了l6种突变类型,其中66位点的A/G多态性存在并对血浆同型半胱氨酸水平有影响,而本研究症明66位点A/A可能为先天神经管缺陷的保护性基因。事实上先天神经管缺陷的发病过程中一定有多种基因的参与,环境因素也定然起着它的作用。MTRR的66位点A/G多态性与先天神经管缺陷的分布无明显关系,说明其与病情无明显相关性,但由于样本量较小,这方面仍需进一步研究。

[1]蒋 彦,蒋健穗,杨芳华,等.胎儿先天畸形产前诊断及临床分析[J].中国优生与遗传杂志,2006,14(2):71.

[2]赵 琳,李 莲,陈秀兰,等.十堰市孕中期妇女产前筛查结果分析[J].微循环学杂志,2010,20(3):64.

[3]王龙武,石 柯,彭爱红,等.一种快速微量外周血基因组 DNA的提取方法[J].中国现代医学杂志,2004,14(2):70.

[4]Frosst P,Blom HJ,Milos R,et al.A candidate genetic risk factor for vascuiar disease:a Common mutation in methylenetetra hydrofolate reductase[J].Nature Genetics,1995,10(1):111.

[5]孕妇血清叶酸、同型半胱氨酸水平与胎儿神经管畸形危险性研究[J].中国生育健康杂志,2009,20(4):200.

[6]Perma AF,Ingrosso D,Lombardi G.Possible mechanisms of homocysteine toxicity[J].Kidmey Int Suppl,2003,5,(84):137.

[7]Brown CA,McKinney KQ,Kaufman JS.A common polymorphism in methionine synthase reductase increases risk of premature coronary artery disease[J].J Cardiovasc Risk,2000,7(3):197.

[8]Gaughan DJ,Kluitmans LA,Barbuax S,et al.The methionine synthase reductase(MTRR)A66G polymorphism is a novel genetic determinant of plasma homocystein concentration[J].Atherosclerosis,2001,157(2):451.

[9]De Marco P,Calevo MG,Moroni A,et al.Study of MTRR and MS polymorphisma as risk factors for NTD in the Italian population[J].J Hum-Genet,2002,47:319.

[10]Cos M,Sliwerska E,Szpecht-Potocka A,et al.Mutation incidence in folate metabolism genes and regulatory gene in Polish families with neural tube defects[J].J Appl Genet,2004,45:363.