张满英,景 影*,李 蕊,毕经瑞,孙连坤,娄长芹

(1.吉化集团公司总医院,吉林吉林市132022;2.吉林大学白求恩医学院 病理生理教研室)

谷氨酸是中枢神经系统兴奋性突触传递的主要神经递质,维持正常脑功能,但较高浓度谷氨酸则具有神经毒性作用[1],中枢神经系统内含有大量兴奋性氨基酸[2],几乎所有的神经元都含有谷氨酸受体,随着分子生物学技术的发展,到目前已克隆出8种mGluRs,分别命名为 mGluR1-mGluR8,mGluR1-3,mGluR5-7的脑保护作用已被证实[3],由于mGluR-4、mGluR-6受体分布的局限性及缺少对不同亚型受体选择性作用的药物,它们与脑损伤及神经保护剂的作用还需进一步证实。

糖尿病是缺血性脑血管病的危险因素,高血糖对缺血性脑卒中的病情和转归有负面影响[4]。目前关于糖尿病脑损伤时代谢型谷氨酸受体及谷氨酸转运体基因表达方面报道较少,本研究着重观察糖尿病脑损伤大鼠代谢型谷氨酸受体、谷氨酸转运体基因的表达情况,探讨他们在脑保护方面的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组 清洁级近交系Wistar大鼠28只,雌雄不限,重约160-200 g,购自吉林大学实验动物中心。STZ、戊巴比妥钠购自Sigma公司。鼠随机分成A(常规饲料喂养组,n=14)、B(高糖高脂饲料喂养+STZ注射诱导胰岛素抵抗,即模型组,n=14)二组,自由进食水,12 h光照周期。

1.2 试剂与仪器 PCR扩增仪、PCR热循环仪、DL2000DNA Marker、Taq DNA聚合酶均产自TAKARA公司,日本;RNA定量仪,SANYO,日本;PCR引物合成由联星公司,中国;兔抗大鼠胰岛素多克隆抗体,麦新公司,美国。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立

高糖高脂饲料喂养大鼠饲养一个月后,B组大鼠一次性腹腔注射60 mg/kgSTZ(以pH4.2的11 mol/L枸橼酸缓冲液配成125%浓度)诱导糖尿病,A组仅注射枸橼酸缓冲液作对照。测定血糖。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法。血标本在1%戊巴比妥麻醉下(30 mg/kg)从眼内眦静脉取,EDTA抗凝。胰腺组织胰岛素染色:常规方法处理玻片,脱蜡,3%H2O2孵育 25 min,阻断内源性过氧化物酶,PBS洗 5 minx3,正常羊血清50 μ l/片滴于组织片上封闭非特异蛋白,室温下孵育20 min,封闭非特异位点,FITC(中山公司)发色,视显色强度而定时间。

1.4 PCR 检测 EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA表达

取冻存的6个月糖尿病鼠脑组织100 mg,加入1 ml Trizol,用匀浆机把组织搅碎,室温放置5 min,使其充分裂解。离心、沉淀、干燥后提取细胞总RNA,经逆转录成cDNA,用相关基因的引物扩增其基因的片段,观察mRNA表达情况。反应条件:循环1 95℃5 min,循环 2 94℃30 s,56℃1 min,72℃1 min,30循环 ,循环 3 72℃ 10 min。EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6引物序列分别为:正义5'-CCCGGAAGAACCCCTGGGTTT-3',反义 5'-GTTCATT GTCCTG GGCAATCA-3',PCR产物572 bp;正义 5'-TGAGCTACGTGCTGCTGGCG-3',反义 5'-TGTCGGCTGACTGTGAGGTG-3',PCR产物 329 bp;正义 5'-CAAGTAGCAAGGTTGAGTGT-3'反义5'-GGTTGTAGTGTTGGATCAAG-3'PCR产物280 bp。

1.5 统计学方法

各组数据采用mean±SD表示,统计学处理采用SPSS11.5软件分析,各实验组间均值比较采用ANOVA。

2 结果

2.1 大鼠空腹血糖浓度

模型组空腹血糖20.016±1.984 mmol/L,对照组空腹血糖3.882±0.123 mmol/L(P＜0.01),模型组空腹血糖明显高于正常(＜7.0 mmol/L),符合糖尿病诊断标准。

2.2 大鼠胰腺组织胰岛素染色

激光共聚焦显微镜下观察组织中胰岛素表达,照相。结果显示对照组胰腺组织中可见大量胰岛细胞,糖尿病模型组胰腺组织中胰岛细胞显著减少。

2.3 PCR检测大鼠脑皮质 EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA的表达

反应结束后,进行1%的琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像分析系统中观察并照相记录。RT-PCR结果显示:糖尿病模型组mGluR-6 mRNA表达与对照组相比明显增强(P＜0.05),而 EAAT-1、mGluR-4 mRNA表达与对照组相比略有增强,但未见统计学意义。

图1 胰腺组织胰岛素染色

图2 RT-PCR检测大鼠脑皮质 EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA的表达

3 讨论

糖尿病合并脑损伤已成为当前严重危害人类生命与健康的常见因素[5],其发病后症状重、预后差、死亡率高,给社会和家庭带来的沉重影响越来越得到学者的关注,脑损伤的发病机制仍不很明确,研究认为可能主要与糖尿病代谢紊乱所致的微血管、大血管病变以及血液流变学和抗凝纤溶系统异常有关[6]。

为探讨糖尿病合并脑损伤的发病机制,我们对复制的糖尿病大鼠模型从分子生物学角度在脑神经代谢方面进行相关检测和对照研究,旨在为阐明糖尿病脑损伤的机制及为临床预防和治疗糖尿病并发脑损伤提供科学的依据。

本实验是对通过饮食诱导胰岛素抵抗的大鼠一次性STZ注射,诱发产生糖尿病模型,客观真实的模拟脑损伤的过程,符合临床发病规律。经胰岛素染色和血糖测定结果证实糖尿病动物模型是成功的。

本研究提示:6个月糖尿病大鼠脑皮质内代谢型受体mGluR-6表达增加,说明mGluR-6可能在糖尿病脑损伤的发生发展过程中扮演着一个重要的角色,本研究认为糖尿病鼠脑谷氨酸释放增多,导致与脑缺血、缺氧及变性疾病有关的兴奋毒作用[7],mGluR-6可减少或阻断突触前谷氨酸的释放,减少缺血引起的脑组织损伤,起到脑保护作用,为进一步探索脑损伤机制及神经保护提供了理论依据。

[1]虞希冲.谷氨酸转运体、谷氨酸/胱氨酸转运体与神经细胞毒作用[J].中国临床药理学与治理疗学,2003,8(5):490.

[2]周雯慧.谷氨酸、NMDA受体和新生儿缺氧缺血性脑损伤[J].国外医学妇产科分册,2004,31(1):17.

[3]Ferraguti F,Shigemoto R.Metabotropic glutamate receptors[J].CellTissue Res,2006,326(2):483.

[4]王 莹,张朝东.糖尿病与缺血性脑血管病的相关性[J].中国临床康复,2003,7(31):4276.

[5]Aronow WS,AhnC.Risk factors for new atherothrombotic brain infarction in older Hispanic men and women[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2002;57(1):61.

[6]吴 毅,吴军发.2型糖尿病患者的康复治疗与评价[J].中国临床康复,2002,6(15):2202.

[7]Hoogeveen EK,KostensePJ,JakobsC,et al.Hyperhomocy steine increased risk of death,especially in type 2diabetes[J].Circulation 2000,101:1506.