陈 春，李永翔*，罗庆礼

(1安徽医科大学第一附属医院，合肥230032;2安徽医科大学教育部省部共建重要遗传病基因资源利用重点实验室)

Fox是脊椎动物叉头样转录因子的总称，通常与细胞生长发育的调控有关［1］。Foxp3是叉头样转录因子P亚家族成员，特异性表达于CD4+CD2+5调节性T细胞(Tregs)，通过反转录病毒转染Foxp3基因能促使初始T细胞向CD4+CD2+5Tregs分化，因此其被看作参与CD4+CD2+5Tregs 分化的重要分子［2］。2010年5～12月，我们成功将Foxp3基因构建在慢病毒表达载体PWPXL-MOD上，并与包装慢病毒所必需的相关质粒共转染人胚肾293T细胞，成功收获了携带Foxp3的慢病毒载体，并对病毒进行纯化、浓缩，为体外获得CD4+CD2+5Tregs奠定基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 Foxp3基因质粒(Genescript公司合成)，PWPXL-MOD载体、四种包装质粒载体(pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、干扰质粒，上海奥鹏生物有限公司)，Taq DNA聚合酶、T4连接酶(TOYOBO公司)，限制性内切酶(Takara公司)，凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒(Axygen公司)，DNA marker(DL2000和DL3000，大连宝生物公司)。其他试剂均为国产分析纯。人胚肾293T细胞株购自ATCC公司，大肠杆菌菌株DH5α、胎牛血清以及胰蛋白酶购自Invitrogen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 FoxP3基因片段制备及目的片段克隆与鉴定 Foxp3基因两端分别插入的酶切位点为MluⅠ和EcoRⅠ。用EcoR V酶切pUC57载体，将其与目的基因片段采用T4 DNA连接酶进行连接反应，4℃，连接过夜;连接产物转化感受态DH5α，涂布氨苄青霉素抗性琼脂糖(LB)平板培养基，37℃过夜培养。用MluⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、测序鉴定，测序结果与GenBank中的基因序列进行对比。

1.2.2 携带Foxp3基因的慢病毒表达载体的构建 对测序正确的酶切产物进行DNA凝胶回收及纯化，分别用MluⅠ和EcoRⅠ酶切pUC57-Foxp3载体和PWPXL-MOD慢病毒表达载体，参考Cao等［3］的方法构建Foxp3与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体。抽提质粒，酶切、测序鉴定。测序结果与GenBank中的基因序列进行对比。

1.2.3 病毒包装、纯化及滴度测定 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体，其中 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G含有病毒包装所必须的元件，干扰质粒能表达GFP。分别进行高纯度无内毒素抽提，采用磷酸钙沉淀法共转染293T细胞，转染8 h后更换为完全培养基，培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，超离心纯化获得高滴度的慢病毒浓缩液，用逐孔稀释滴度法测定。感染293T细胞后用流式细胞术检测病毒滴度。

2 结果

2.1 Foxp3基因片段扩增结果 将目的基因连接后的重组质粒经MluⅠ和EcoRⅠ酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下除了相应载体条带外分别可见2 710、1 275 bp的DNA片段，与理论计算片段一致(详见图1)。测序结果与GenBank中的基因序列比对显示序列一致。

图1 MluI和EcoRI酶切后pUC57载体

2.2 Foxp3基因与EGFP共表达载体的酶切及测序鉴定结果 用MluⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆载体，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下除了相应载体条带外分别可见2 283、1 275 bp的DNA片段，与理论计算片段一致(详见图2)。测序结果与GenBank中的基因序列比对显示序列一致。

2.3 病毒滴度测定结果 病毒感染293T细胞后，流式细胞术测定的病毒滴度为3.3×108IU/ml。

图2 MluⅠ和EcoRⅠ双酶切后Foxp3基因与EGFP共表达载体

3 讨论

CD4+CD2+5Tregs是抑制性T细胞的一种亚群，其在大、小鼠和健康人体中约占外周CD4+T细胞的5% ～10%。有学者发现［4］，将清除了 CD4+CD2+5的CD4+T细胞输注给nu/nu小鼠，会引起器官特异性自身免疫性疾病的发生，但若同时输注CD4+CD2+5Tregs即可避免。CD4+CD2+5Tregs不仅能够抑制急性排斥反应同时也具有抑制慢性排斥反应、延长移植物存活时间的作用。在维持外周耐受、防止自身免疫性疾病中发挥重要作用［4，5］。

Foxp3基因在CD4+CD2+5Tregs的发育和功能中起着决定性作用。人类同源的Foxp3基因突变可引起免疫失调、多发性内分泌疾病、肠病、x染色体性联综合征(IPEX)［6］。Walker等［7］通过转基因技术人为的使CD4+CD2－5T细胞表达Foxp3，发现这些转染后的细胞获得了Tregs的表型和功能。

Foxp3基因的编码产物为48 kD的蛋白质scurfin，其以IL-2依赖的受体作为转录阻遏物，但是体内确切的靶点仍不清楚。在scurfin缺陷的突变小鼠内可发生CD4+T细胞相关淋巴细胞增生病。外周T细胞可以通过转基因或者转化生子因子-β(TGF-β)诱导表达Foxp3而获得具有 CD4+CD2+5Tregs功能［8，9］。输注Treg利用其强大的免疫调节作用诱导同种异体移植免疫耐受成为一种新的免疫耐受诱导措施［10］。

以病毒介导的基因转移成为目前最主要的基因转移方法之一，但反转录病毒载体无法高效转染非分裂期细胞，而慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还能将较大的目的基因片段整合到宿主细胞中，并能够持续稳定的表达目的基因。故成功构建慢病毒载体，对体外获得CD4+CD2+5Tregs有着重要意义。

研究中我们选择慢病毒作为载体，因为CD4+CD2－5T细胞增殖能力低，而慢病毒载体是在人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系中。慢病毒载体基因组是正链RNA，其进入细胞后，在细胞质中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞质中，表达目的蛋白。因目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂，因此慢病毒载体介导的基因表达作用持续且稳定。本研究中我们得到了高滴度的慢病毒载体，为体外获得CD4+CD2+5Tregs奠定了基础。

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