王贺玲，张 健，李 岩，王学清

顺铂(CDDP)作为治疗多种实体瘤的临床一线用药，是胃癌的常用化疗药物。其作用类似烷化剂，主要通过特异结合DNA，使链内及链间发生交链，干扰DNA复制、RNA及蛋白质的合成［1-5］。5-Aza-CdR是明确的去甲基化药物，能与DNA甲基转移酶共价结合，降低DNA甲基转移酶的生物活性，以进一步使基因去甲基化，使失活基因重新表达。本文通过对低剂量顺铂与5-Aza-CdR联合用药，观察两者对胃癌细胞生长及DAPK1基因的影响，探讨5-Aza-CdR是否能够作为一线化疗药物顺铂的辅助用药，使该药物在较低剂量时发挥较大的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 BGC823细胞系购自中国医科大学细胞生物教研室，5-Aza-CdR及碘化丙啶(PI)为Sigma产品，顺铂(CDDP)为贵州汉方制药有限公司产品。RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，RPMI 1640培养基为Hyclone产品，Taq酶及dNTP均为TaKaRa公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 CDDP与5-Aza-CdR联合用药对胃癌细胞的影响:胃癌BGC823、SGC7901细胞培养于含10%胎牛血清、1%链霉素，青霉素的RPMI1640培养液于37℃、50 mL/L CO2条件下培养。

1.2.2 MTT检测细胞生长活性 (1)CDDP对胃癌细胞的影响:取处理前的对数生长期的细胞，按每孔2×103(200 μL)接种于96孔板，共接种5板，每组6孔。接种24 h后去上清液，加入含CDDP(1×10－6mol/L)的培养液继续放入 CO2孵箱，在37℃、5%CO2及饱和湿度下继续培养，以后在24、48、72 h各时间点分别取一板，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h。终止培养，去除孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，其增殖能力大小以平均吸光度(A)值分析。以未加CDDP干预的细胞为对照组。(2)CDDP与5-Aza-CdR联合用药对胃癌细胞生长的影响:将胃癌细胞传代24 h后，加入含5-Aza-CdR(1×10－6mol/L)的培养液，作用 48 h后，将细胞按每孔2×103(200 μL)接种于96孔板，共接种5板，每组6孔，接种24 h后去上清液，加入含CDDP按(1×10－6mol/L)的培养液继续放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2及饱和湿度下继续培养，以后在24、48、72、96、120 h 各时间点分别取一板，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h，终止培养，去除孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，选择570 nm 波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，其增殖能力大小以平均吸光度(A)值分析。以未加5-Aza-CdR干预的细胞为对照组。

1.2.3 半定量RT-PCR分析 DAPK1的表达:用Trizol试剂提取各组BGC823细胞总RNA，用逆转录酶和Oliga(dT)20引物合成cDNA。DAPK1引物序列上游引物:5'-GCCTGGAGACGGAGAAGAT-3'，下 游 引物:5'-AAGTCCCGTGGCTGGTAGA-3'，扩增长度为172 bp。以 β-actin为内参，上游引物:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下 游 引 物:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，扩增长度为498 bp。两对引物均加入25 μL反应体系中，PCR反应条件:94℃变性45 s，58℃复性45 s，72℃延伸60 s，共35个循环。RT-PCR产物经2%琼脂糖胶分离，用Alpha Image 2000自动成像仪摄影，用Fluorchem V 2.0 Stand Alone软件分析RT-PCR产量。

2 结果

2.1 生长曲线 从生长曲线可以看出，SGC7901细胞与BGC823细胞在5-Aza-CdR(1×10－6mol/L)的作用下生长受到一定的抑制，而在低浓度的CDDP(1×10－6mmol/L)的作用下生长为接近直线，无明显的对数生长期，而在两种药物的联合作用下，生长曲线出现了下降的趋势，说明此两种药物的联合有协同作用。见图1、图2。

图1 SGC7901细胞在用药前后生长曲线

2.2 DAPK1基因的mRNA的表达情况 细胞目的基因cDNA与β-actin cDNA光密度比值与对照组的两者光密度比值进行比较，增高30% ～70%为上调，减少30% ～70%为下调。在细胞中联合用药组亦见明显的该基因表达上升(与CDDP组比较)。而用药后DAPK1基因的表达均明显上升，尤其在联合用药组，2株细胞中该基因表达均明显上升(与CDDP组比较)。见表1。

图2 BGC823细胞在用药前后生长曲线

表1 SGC7901细胞与BGC823细胞在用药前后各目的基因的mRNA表达情况(目的基因光密度/β-actin)(±s)

表1 SGC7901细胞与BGC823细胞在用药前后各目的基因的mRNA表达情况(目的基因光密度/β-actin)(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与5-Aza-CdR组比较，#P＜0.05;与 CDDP组比较，ΔP＜0.05

SGC7901细胞 DAPK1 BGC823细胞DAPK1对照组 0.221±0.024 对照组0.165±0.003 5-Aza-CdR(5×10－6 mol/L)48 h 0.524±0.008*5-Aza-CdR(1×10－6 mol/L)48 h 0.472±0.035*CDDP(5×10－6 mol/L)48 h 0.772±0.011*#CDDP(1×10－6 mol/L)48 h 0.373±0.021*联合用药组48 h 0.812±0.006*#Δ 联合用药组48 h 0.56±0.023*Δ

3 讨论

胃癌化学治疗的主要作用机制为诱导肿瘤细胞凋亡，诱导凋亡能力的强弱与化疗敏感性密切相关，在化疗基础上辅以促进凋亡的药物，可显著提高胃癌的化疗敏感性［6］。近年来，许多体内外研究表明，5-Aza-CdR与CDDP在肿瘤的治疗上具有协同作用。研究表明，CDDP化疗药物的耐药机制与该药物诱导了部分基因的甲基化有关，而5-Aza-CdR是明确的去甲基化诱导剂，对细胞的凋亡均有诱导作用［7-8］。在对宫颈癌的研究中发现，CDDP和5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-CdR)联合应用于ME180人类宫颈鳞状上皮癌细胞系和6个单克隆细胞(在ME180基础上培养出的具有对CDDP抵抗的次克隆ME180细胞)，明显提高了对母系细胞和对CDDP抵抗的次克隆细胞对CDDP的敏感性。5-Aza-CdR的应用迅速逆转了对CDDP抵抗细胞已增加的敏感性，而母细胞对CDDP敏感性的提升至少可保持24 h。相较于母系细胞，RT-PCR显示，CDDP抵抗的次克隆表达较高的DNA甲基化转移酶(DNMT)mRNA水平，DNMT的表达提升很容易恢复次克隆细胞(去除5-Aza-CdR后)对CDDP的抵抗。虽然母细胞显示了DAPK启动子区域的高甲基化，但在2个CDDP抵抗的次克隆细胞中，未发现相应的甲基化区域(MSP)。6株CDDP抵抗的次克隆细胞DAPK的表达均比母细胞高。对CDDP的抵抗伴随着分子的变化，扰乱DAPK转录后的翻译，这些分子变化可由去甲基化而短暂恢复［9］。在对前列腺癌的研究中，当5-Aza-2'-CdR单独加入DU145中培养时，不能诱导明显的凋亡。而与CDDP联合用药后，在控制DU145细胞凋亡坏死中表现了强大的协同作用［10］。CDDP是神经细胞瘤的主要化疗药物。近年研究表明，在此进程中，药物诱导的DNA甲基化扮演重要角色，而5-Aza-2'-CdR能恢复其对CDDP的敏感性［11］。在胰腺癌肿瘤发生的过程中，甲基化状态的改变已经被认为是一种可能的表观遗传学改变。由于对传统药物治疗抵抗的肿瘤预后较差，在用甲基酶抑制剂5-Aza-CdR对不同胰腺癌细胞系处理后，发现基因广泛的去甲基化诱导使其对各种化疗药物的敏感性增加［12］;而5-Aza-CdR亦能够提高精母细胞瘤细胞系对CDDP的敏感性［13］。

本实验研究了低浓度CDDP(1×10－6mol/L)对胃癌细胞的影响，发现其仅对胃癌细胞生长有抑制作用，与5-Aza-CdR共同作用于胃癌细胞后，发现细胞凋亡较单独CDDP作用时明显升高，表明5-Aza-CdR能够增加胃癌细胞对低浓度CDDP的敏感性。

肿瘤细胞凋亡受众多凋亡相关基因调控，DAPK1基因即死亡相关蛋白激酶-1(Death-associated protein kinase-1)也是一种调节细胞凋亡的正调控因子。研究表明，DAPK1作为一种细胞凋亡的正性调节因子，其表达低下或缺失与胃癌的发生发展密切相关;检测DAPK1蛋白可以作为判断胃癌细胞的分化程度及肿瘤类型的新的分子生物学指标，为临床诊断、治疗提供新的靶点［14-16］。许多研究亦证实，该基因在胃癌中的高甲基化状态与该基因的表达下降有明显的关系［17］。在联用5-Aza-CdR与5-FU、PTX、OXA等药物的体外实验中亦发现，胃癌细胞对化疗药物的敏感性提高与DAPK表达有关［18］。从本实验结果亦可以看出，在胃癌细胞中，DAPK基因在5-Aza-CdR增加CDDP药敏性方面起到重要作用。考虑此两种药物的协同作用与细胞凋亡基因的表达增加有关，两种药物与目的基因去甲基化，使其表达逆转，从而进一步增加CDDP对肿瘤细胞的作用。

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