张 梅，赵 雨，李芸彤，徐云凤，曲晓波

长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，长春 130117

哈蟆油(Oviductus Ranae)是中国雌性林蛙(Rana temporaria chensinensis David)的干燥输卵管[1]。据报道，哈蟆油具有促进卵泡早熟及卵泡增殖作用，对性周期有明显的影响，可延长兴奋期，有良好的强精作用；同时具有补虚、退热之功效，可用于治疗精血不足、体虚气弱、肺虚咳、神经衰弱、记忆减退、产后无乳以及肺结核、肝炎等消耗性疾病[2-3]。哈蟆油遇水膨胀后黏稠度很大，水溶性较低，不利于人体吸收及产品加工。哈蟆油的主要成分是蛋白质，约占60%[4-5]。本研究采用碱性蛋白酶制备了低粘度、高溶解性的哈蟆油酶解物，同时进行了抗疲劳、耐缺氧、降血脂等相关药理活性研究，为哈蟆油的进一步研究和开发提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

DS-1型组织匀浆器(上海正慧工贸有限公司)；HH.S21-8-S型恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)；TDL-5-A型离心机 (上海安亭科学仪器厂)；LL3000型冷冻干燥机(德国Heto公司)；DV-Ⅱ+P型旋转粘度计（Brookfield 公司）；游泳箱(50cm×40cm×35 cm)。

碱性蛋白酶(Sigma公司)；血清总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒均购自上海科欣生物技术研究所。

1.2 药材

哈蟆油购于吉林省白山市北亚药业，经本校中药鉴定教研室姜大成教授鉴定为中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的干燥输卵管。

1.3 试验动物

SPF级BALB/C种雄性小鼠140只，体重为(20±2)g，Wistar 雄性大鼠 96 只，体重为(180±20)g，购于吉林大学实验动物中心，合格证号：SCXK—（吉）2008—0005。

2 方法与结果

2.1 哈蟆油酶解物的制备

哈蟆油去除筋膜等杂质后晾干，研磨成粉末，精确称取100.0 g粉末，蒸馏水发制24 h后匀浆。加热煮沸4 h，冷却至室温，调节pH值为8.5。按酶与底物浓度为1000U·g-1加入碱性蛋白酶，60℃酶解30min，加热煮沸10 min灭酶活。5000 r·min-1离心20 min，取其上清液，真空冷冻干燥，冻干品即为哈蟆油酶解物，冻干品收率为87.2%。酶解后的哈蟆油由最初粘度3127 mPa.s降为8.86 mPa.s；Folin-酚法测其蛋白含量为57.4%；硫酸-苯酚法测其糖含量为25.3%。

2.2 哈蟆油酶解物抗疲劳试验

小鼠70只，随机等分为7组(n=10)，即哈蟆油及其酶解物低、中、高剂量组(0.15、0.3、0.6 g·kg-1)和空白对照组，空白对照组给予等体积的蒸馏水。每天灌胃给药1次，连续给药30 d。末次给予受试样品30 min后，将尾根部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深约30 cm，水温(25±1.0)℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。记录试验数据并进行方差分析。

由表1可知，酶解前后各剂量组与对照组比较均能延长小鼠游泳时间，酶解前低剂量组延长具有显著性意义(P＜0.05)，酶解后各剂量组延长均无显著性意义 (P＞0.05)。表明哈蟆油具有一定的抗疲劳作用，而酶解物抗疲劳作用不明显。

2.3 哈蟆油酶解前后的耐缺氧试验

末次给药1 h后，将各组小鼠逐只放入盛有5 g钠石灰的250 mL磨口瓶内，每瓶1只，加盖，以凡士林密封瓶口，旋紧密封，立即计时，以呼吸停止时间为指标，观察小鼠因缺氧而死亡时间，记录试验数据并进行方差分析。

由表1可知，酶解前后各剂量组与对照组比较均能延长小鼠常压耐缺氧存活时间；酶解前各剂量组无显著性意义(P＞0.05)；酶解后各剂量组具有显著性意义(P＜0.05)。表明哈蟆油酶解物能明显增强小鼠耐缺氧能力，减少缺氧对机体重要器官功能的影响。

2.4 哈蟆油酶解物辅助降血脂试验

2.4.1 大鼠分组与给药大鼠适应性饲养观察5 d，取尾静脉血测定TC、TG和HDL-C等各项血脂指标。将大鼠随机分为8组，每组12只，并适当调整使各组大鼠的TG、HDL-C及初始体重尽可能均衡。设基础饲料对照组，高脂模型对照组（高脂组），蛤蟆油及其酶解物低、中、高3个剂量的试验组（剂量分别为 0.05、0.1、0.2 g·kg-1）。基础饲料对照组给予合成饲料，高脂组给予高脂饲料，受试各剂量组在给予高脂饲料的同时给予受试药物。每周称重一次，并根据体重调整给药量。灌胃给药，每天1次，连续给药30 d。

表1 哈蟆油及其酶解物对小鼠负重游泳时间和小鼠常压耐缺氧存活时间的影响(n=10,±s)

表1 哈蟆油及其酶解物对小鼠负重游泳时间和小鼠常压耐缺氧存活时间的影响(n=10,±s)

注：*与对照组相比P＜0.05，表示差异显著。

2.4.2 测定指标依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》2003版[6]相关规定，采用脂代谢紊乱模型法-预防性给受试样品，试验至第30 d取血，采用酶联法测定TC、TG和HDL-C含量，采血前动物禁食16 h，记录试验数据并进行方差分析。

由表2可知，试验前对照组、高脂组及各剂量组各项指标均无显著性差异。实验后高脂组与对照组比较，TC、TG含量均比对照组升高，且具有显著性差异(P＜0.05)，表明高脂模型组建模成功。

表2 哈蟆油酶解物对大鼠血脂的影响(n=12，±s)

表2 哈蟆油酶解物对大鼠血脂的影响(n=12，±s)

注：*与高脂模型组相比P＜0.05，#与基础对照组相比P＜0.05，表示差异显著。

实验后各用药组与高脂模型组比较，各剂量组TC含量均降低，且蛤蟆油及其酶解物低、高剂量组TC含量降低具有显著性意义(P＜0.05)；各剂量组TG含量降低也具有显著性差异(P＜0.05)。表明哈蟆油酶解物具有辅助降血脂的作用。

3 讨 论

运动耐力的提高是抗疲劳能力增强的最有力表现，游泳时间的长短可以反映运动疲劳的程度[7]。提高机体的耐缺氧能力，就是要通过降低机体缺氧应激强度、促进缺氧适应等手段，减弱缺氧对机体的损伤，使机体在长期缺氧环境中尽可能维持较正常的生理机能[8]。现有研究表明，血脂在维持人体正常生理活动中发挥重要作用[9-10]。而血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平是反映机体脂质代谢的主要指标。

采用酶法水解蛋白，即可以产生大量具有多种生物功能的多肽，同时反应底物、反应剂和反应环境没有污染[11]。本研究通过对哈蟆油酶解物的抗疲劳、耐缺氧及降血脂作用的研究，表明哈蟆油酶解物能延长小鼠负重游泳时间及缺氧小鼠的存活时间，提高小鼠耐缺氧能力，维持小鼠较正常的生理机能；同时，哈蟆油酶解物各剂量组对甘油三酯含量的降低均具有显著性意义，其中低、中剂量组尤为显著，高剂量组效果次之，为考察降低甘油三酯量效关系提供了一定的实验基础；哈蟆油酶解物也能显著降低大鼠血清总胆固醇含量，根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)[6]，在血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇三项指标检测中血清总胆固醇和甘油三酯二项指标阳性，可判定该哈蟆油酶解物保留了蛤蟆油的辅助降血脂功能，为哈蟆油保健产品的研究与开发奠定了基础。

[1] 刘永镇，徐光俊.哈蟆油真伪鉴别研究的回顾和展望[J].延边医学院学报， 1990，3(1)：70-2.

[2] 王春林.哈什蟆油甾体性激素定量分析及药理作用[J].中药通报，1985，10(2)： 44-47.

[3] 沼田光弘.游离脂肪酸新制剂[J].化学工业，1986，(10)：763-768.

[4] 王 萍，杨春瑜.林蛙油的成分及开发利用前景[J].国土与自然资源研究， 1999，(2)：69-73.

[5] 林纪娴，廖静华.中国林蛙油与中华大蟾蜍输卵管的蛋白质成分研究[J]. 中药材，1986，(6)：15-20.

[6] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003.

[7] 孙冬菊，黄德苓，张兆强，等.无花果水提取物对小鼠抗疲劳、耐缺氧作用的实验研究[J].职业与健康，2007，23(13)：1105-1108.

[8] 张 旭，张汝学.中药复方提高机体耐缺氧能力及机制的研究进展[J]. 中医药学刊，2007，(9)：18-24.

[9] 李来好，戚 勃，杨少玲.麒麟菜膳食纤维的降血脂功能[J]. 中国水产科学，2008，15(6)：944-948.

[10] 张纯萍，刘雪萍，黄兴振，等.茶籽油降血脂及抗动脉粥样硬化的药效学 [J].中国医院药学杂志，2007，27(5)：596-598.

[11] 马燕梅.林蛙油酶解条件的优化及其蛋白水解营养液的研制[D].吉林农业大学硕士论文，2007.