张晶晶 ，陈 军 ，方 芸

1南京大学医学院附属鼓楼医院药剂科，南京 210008；

2南京中医药大学药学院，南京 210029

目前的抗肿瘤药物脂质体普遍采用了长循环技术，应用聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPEPEG）作为长循环材料的抗癌药物脂质体已经在临床上得到应用，但是这种材料价格昂贵，目前难以得到推广应用。研究表明，在脂质体中掺入表面活性剂吐温80也可以通过改善表面亲水性而达到长循环效果[1,2]。吐温80掺入后，脂质体中磷脂极性头部被吐温 80的聚氧乙烯基所覆盖，伸出的亲水性聚氧乙烯基提供了长循环脂质体的立体位阻[3]。有文献[4]比较了吐温80与DSPE-PEG2000修饰对超氧化物歧化酶脂质体药物动力学的影响，结果表明两种修饰都具有显著的长循环效果，但DSPEPEG2000的效果更好。由于吐温80修饰的长循环效果确切且机理清楚，因此我们采用其替代DSPEPEG作为修饰材料制备长循环脂质体，并考察了对9-硝基喜树碱（9-nitrocamptothecin，9-NC）脂质体体内药物动力学、尤其是内酯型/羧酸盐型平衡的影响 （有关长循环脂质体和普通脂质体对9-NC内酯型/羧酸盐型平衡作用的比较尚未见报道）。

1 实验材料

1.1 仪器与设备

HP Agilent 1100高效液相色谱仪（包括G1312A二元泵，G1313A自动进样器，G1314A紫外可变波长检测器）；TGL-16G高速离心机 （上海安亭科学仪器厂）；XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）。

1.2 药品与试剂

9-NC原料药（中国药科大学药物化学教研室提供，纯度＞99%），9-NC 脂质体（采用薄膜法自制）；甲醇（色谱纯）；二甲基亚砜、聚乙二醇400、无水乙醇、三乙胺、冰醋酸均为分析纯；吐温80（中国医药集团上海化学试剂公司，化学纯）；其它试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

健康SD大鼠，230-280g，♂，购置于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

2 方法与结果

2.1 RP-HPLC法测定大鼠血浆中9-NC内酯型浓度和总浓度参考文献[4-5]。

2.2 9-NC脂质体的制备

精密称取处方量的磷脂、胆固醇和9-NC（物质的量比为72︰24︰1），用无水乙醇溶解后，减压1 h除去溶剂成膜。真空干燥过夜，加入pH5.9磷酸盐缓冲液4 mL，37℃旋转水合120 min。水合液于冰浴中探头超声（200 W，300次）后即得9-NC脂质体。

2.3 吐温80修饰的9-NC脂质体的制备

按磷脂用量1/5的物质的量之比在成膜时加入吐温80，其余处方工艺同“2.2节”项下制备，样品作为“2.4项下”药物动力学研究。

12只大鼠随机分为两组，按1.5 mg·kg-1剂量分别尾静脉注射给予9-NC普通脂质体和吐温80修饰的脂质体后，于不同时间点取血，4000 r·min-1离心3 min，取血浆200 μL，处理后测定9-NC内酯型浓度和总浓度。采用统计矩模型、利用3P97程序计算药物动力学参数。两组之间的药物动力学参数比较采用t检验。

在选定的色谱条件下，血浆中9-NC内酯型浓度和总浓度的定量不受干扰。

低、中、高3个浓度方法回收率分别为99%±3%，98.5%±0.3%，101.2%±0.4%；日内 RSD 均≤4.0%；日间RSD均≤6.0%；酸化回收率分别为98%±5%，99%±7%，101%±4%。

2.4药物动力学比较

两组大鼠药物动力学试验结果见表1和图1。

从表1中可见，采用表面活性剂吐温80进行修饰后，9-NC内酯型和总浓度的AUC分别提高了1.47倍和1.65倍，内酯型和总浓度的清除率CL和表观分布容积（Vss）显著下降（P＜0.01）。此外，总浓度的平均滞留时间（MRT）以及半衰期t1/2延长（P＜0.05），表明具有一定的长循环效果。

按AUC0-∞计算[6]，吐温80修饰前后的9-NC脂质体的内酯型比例分别为50%±6%和43%±6%。可见，吐温修饰使得内酯型比例有所下降，但没有显著性差异。

表1 大鼠静注1.5 mg·kg-19-NC、9-NC脂质体或吐温80修饰脂质体的药动学参数（n=6,±s）

表1 大鼠静注1.5 mg·kg-19-NC、9-NC脂质体或吐温80修饰脂质体的药动学参数（n=6,±s）

aP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.001 vs 9-NC 脂质体

3 讨 论

文献[7]报道，根据剂量折算，9-NC游离药物大鼠静脉注射剂量为3 mg·kg-1。采用脂质体包封后，AUC显著提高，有效剂量相应地下降。因此在表面活性剂修饰的药物动力学研究部分，我们改用了文献报道的9-NC静脉注射用制剂所采用的1.5 mg·kg-1剂量[8]。

当吐温80用量与磷脂用量的物质的量比为20%时，1HNMR图谱可见卵磷脂的胆碱头部甲基峰明显变小，当用量提高到50%时，磷脂的极性头部为吐温80中聚氧乙烯基所覆盖直至完全覆盖，在1HNMR谱图中表现为该峰的消失[3]。但是当吐温80的物质的量比达到50%时，表面活性剂开始增溶脂质体而形成混合胶团[9]，因此我们选择了20%的用量。

吐温80修饰的结果表明可以显著提高脂质体包封的药物在血浆中的AUC，延缓清除和减小表观分布容积 （P＜0.01），延长总浓度的MRT和t1/2(P＜0.05)，具有一定的长循环效果。吐温80修饰后，9-NC脂质体静脉注射的内酯型比例有所下降，但没有统计学显著性差异。这一结果是由于脂质体表面采用表面活性剂修饰以后，对体内9-NC内酯型/羧酸盐型平衡可能产生相反的影响：一方面，延长了9-NC在循环中的停留时间，抑制了9-NC从血浆中的清除，而这种清除是有利于内酯型稳定的，因此表面活性剂修饰后的长循环作用可能不利于9-NC内酯型的稳定；另一方面，在一定程度上阻止了血浆蛋白在脂质体表面的吸附（调理作用），而血浆蛋白的吸附有利于脂质体中羧酸盐型的稳定[10]，因此这种抑制作用可能会有利于9-NC内酯型的稳定。吐温80修饰脂质体对体内9-NC内酯型/羧酸盐型平衡的影响可能是两方面作用相互抵消后的结果。

[1] 张景勍，张志荣，陈开杰，等.长循环脂质体的研究进展[J]. 药学进展，2003，27（3）：139-42.

[2] Burke WE,Leitzke S,Diederichs JE,et al.Surfacemodified amikacin-liposomes:organ distribution and interaction with plasma proteins [J].J Drug Targeting,1998,5(2):99-108.

[3] 赵 蓉，朱家璧.全反式维甲酸立体稳定脂质体的制备[J]. 药学学报，2000，35（12）：921-3.

[4] 张云龙，谢 英，王会娟，等.超氧化物歧化酶脂质体在大鼠体内的药代动力学和组织分布 [J].药学学报，2005，40（2）：173-7.

[5] 陈 军，平其能，张晶晶，等. HPLC法测定人血浆中9-硝基喜树碱内酯型浓度和总浓度 [J].中国药房，2009，20（2）：111-3.

[6] Chow DS,Gong L,Wolfe MD,et al.Modified lactone/carboxylate salt equilibria in vivo by liposomal delivery of 9-nitrocamptothecin[J].Ann NY Acad Sci,2000,922:164-74.

[7] Zhong DF,Li K,Xu JH,et al.Pharmacokinetics of 9-nitro-20(s)-camptothecin in rats [J].Acta Pharmacol Sin,2003,24(3):256-62.

[8] 李珺婵，方晓玲，沙先谊，等.9-硝基喜树碱半固体脂质纳米粒的制备及大鼠的药动学研究[J].中国医药工业杂志，2004，35（10）：599-602.

[9] 胥传来，姚惠源.聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯与脂质膜间的相互作用的研究[J]. 精细化工，2004，21（13）：897-902.

[10] Mi Z,Burke TG.Differential interaction of camptothecin lactoneand carboxylate formswith human blood components[J].Biochem,1994,33(34):10325-36.