王亚红,张仰眉,肖 凯

(1.内蒙古自治区医院药剂处,呼和浩特 010017;2.第二军医大学海医系毒物药物研究室,上海 200433)

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎,是我国的传统中药。丹参始载于《神农本草经》,味苦、微寒,入心、心包及肝经,具有活血通络、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦等功效[1]。丹参的脂溶性成分为二萜醌类化合物,丹参酮及单体都具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化、改善心肌缺血等药理作用,广泛应用于治疗心血管病的中成药制剂,对治疗冠心病、心绞痛、心动过速有显著疗效。丹参酮的提取一般选择渗漉法或回流提取,在回收溶剂、浓缩、干燥过程中丹参酮损失严重,资源浪费较大。超临界CO2萃取是以超临界状态下的CO2流体为溶剂来提取分离混合物的过程。超临界流体兼具气体和液体的双重特性,具有很强的溶解能力,良好的流动性和传递性。超临界CO2萃取通过调节超临界CO2流体的压力和温度来控制溶解度和蒸气压这两个参数,从而达到物质分离的效果[2]。本研究采用超临界CO2萃取结合柱层析法对丹参原药材进行提取、分离和纯化,以期为工业化生产提供依据。

1 材料和仪器

1.1 仪器 HA221-50超临界CO2萃取仪(江苏华安超临界萃取有限公司);HPLC仪,包括510高压恒流泵和2487双波长检测器(美国Waters公司);N2000色谱工作站(浙江智达信息工程有限公司);旋转蒸发仪(上海仪器厂);FA1004电子天平(上海天平仪器厂)。

1.2 试剂、药品和药材 丹参药材购自河北省安国市,丹参酮ⅡA含量为0.235%,符合《中华人民共和国药典》2010版一部要求[3];丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所,批号110766-200315);乙醇(纯度95%,食品级,国药集团化学试剂有限公司);CO2(纯度99.9%,食品级,上海盖斯工业气体有限公司);中性氧化铝(100～200目,上海五四化学试剂厂);甲醇(一级色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司);无水乙醇、苯(分析纯,天津化学试剂三厂);纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法和结果

2.1 萃取方法 取已粉碎的丹参药材粗粉200 g,装入萃取釜中,当萃取釜和分离釜的压力和温度都达到设定值后,加入夹带剂乙醇,开始萃取,并记录时间。固定CO2流速为 30 L/h,设定工艺参数,静态萃取45 min,动态萃取45 min。在分离釜出口处收集萃取液,量取体积。对萃取液减压回收乙醇,真空干燥,得到萃取物粗品。

2.2 丹参酮ⅡA的含量测定

2.2.1 溶液的配制 (1)对照品储备液:精密称取丹参酮ⅡA对照品 10.2 mg,置50 ml棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得到浓度为0.204 mg/ml的对照品储备液。取对照品储备液适量,置50 ml棕色量瓶中,用甲醇定容,得到浓度为4.08 μ g/ml的丹参酮ⅡA对照品溶液。(2)供试品溶液:精密称取干燥的萃取物粗品0.1 g置50 ml量瓶中,加适量甲醇超声溶解,再用甲醇稀释至刻度,用0.45 μ m微孔滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液0.1 ml置50 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得供试品溶液。以甲醇作为阴性对照品溶液。

2.2.2 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m);流动相 :甲醇-水(75∶25);检测波长:270 nm;流速 :1.0 ml/min;柱温 :室温 ;进样量:10 μ l。在此色谱条件下,取对照品、阴性对照品和供试品溶液进样测定,得到色谱图见图1。由图1可见,色谱峰分离良好,达到定量要求。

图1 丹参酮ⅡA的HPLC谱图Figure 1 HPLC photograms of tanshinoneⅡA

2.2.3 线性关系的考察 精密吸取2.2.1项下的对照品储备液适量,置50 ml棕色量瓶中,用甲醇定容,得到系列浓度为 1.02 、2.04、4.08、8.16、16.32、32.64 μ g/ml的丹参酮ⅡA对照品溶液,按2.2.2项下的色谱条件进样测定,用外标法以峰面积定量。将峰面积(A)对浓度(c)进行线性回归,得标准曲线方程:A=2.2204×10-7c+3.819 3×10-3,(r=0.999 8,n=5),表明丹参酮ⅡA在 1.02～ 32.64 μ g/ml范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 工艺优化

2.3.1 萃取条件的选择 根据预实验结果确定影响萃取效果的4个主要因素:夹带剂用量、萃取釜压力、萃取釜温度和分离釜温度。每个因素设定3个水平进行L9(34)正交试验,考察最佳萃取条件(见表1)。

2.3.2 正交试验 将丹参药材粗粉装入萃取釜中,同时加入夹带剂,按设定的工艺参数进行萃取。试验安排及结果见表2,方差分析结果见表3。

正交试验结果表明,影响超临界CO2萃取丹参酮ⅡA的因素依次为A＞C＞B＞D,最佳工艺条件为A3B1C3D2,即夹带剂乙醇用量为120 ml,萃取釜压力为20 MPa,萃取温度为50℃,分离温度为35℃。在此条件下对工艺进行验证,结果粗提物中丹参酮ⅡA的量为414.2 mg(n=3),质量分数为3.84%。

表1 正交试验的因素和水平设计Table 1 Design of factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验设计和结果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析结果Table3Results of variance analysis

2.4 分离纯化 取超临界CO2萃取得到的丹参酮ⅡA粗提取物30 g溶于20 ml苯中,加10 g中性氧化铝拌和均匀,取12 ml混合物装于中性氧化铝层析柱(70 cm×4 cm,用中性氧化铝250 g)上,用苯洗脱,待色带完全展开后,将氧化铝缓缓倒出,按其颜色分为紫红色段、橙红色段、墨绿色段和暗红色段。将紫红色段氧化铝粉末再装于层析柱上,进一步用苯洗脱,分段收集洗脱液。用丹参酮ⅡA对照品作为对照,采用薄层色谱对流份进行跟踪检测,收集富含丹参酮ⅡA的流份,减压回收溶剂,用 20%(V/V)无水乙醇重结晶,静置过夜,得到红色针状结晶。经HPLC法测得晶体中丹参酮ⅡA的质量分数为93.49%。

3 讨 论

索氏提取法和乙醇浸提法提取丹参酮ⅡA的主要缺点是提取率低、杂质较多、颜色较深,提取耗时长、损失大。索氏提取法和乙醇浸提法萃取物中丹参酮的含量分别为16.1%和 18.8%[4]。超临界CO2萃取的粗提物中丹参酮ⅡA含量明显提高,但离单体还有很大差距。粗提物经柱层析分离后可以得到较高纯度丹参酮ⅡA,层析得到的其他各段分离物的成分还有待进一步的研究确定。本研究结果显示,用超临界CO2萃取提取丹参酮ⅡA是可行的,与其他方法比较有一定的优势[5,6],仅用少量安全的常规溶剂乙醇作夹带剂即可,并且生产周期短,提取效率高。本研究对于超临界CO2萃取丹参酮的工业化生产具有一定的指导意义。

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[2] 张镜澄.超临界流体萃取[M].北京:化学工业出版社,2002:4-130.Zhang JingCheng.Supercritical fluid extraction[M].Beijing:Chemical Industrial Press,2002:4-130.Chinese.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:70-71.State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia ofthe People's Republic of China.2010 ed,Volume 1[S].Beijing:Chinese M edical Science Press,2010:70-71.Chinese.

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