王志君,宋洪杰,陆松伟,尤本明(第二军医大学长海医院药学部,上海 200433)

珍珠维E乳膏是第二军医大学长海医院皮肤科临床用于治疗黄褐斑、雀斑、老年斑及日晒斑等皮肤病的一种特色制剂,主要成分有维生素B6、维生素E和尿素。原质量标准仅测定尿素含量,对反映药效的维生素B6和维生素E未建立质控方法。本研究建立了梯度洗脱RP-HPLC法同时测定珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E的含量,旨在更好地控制珍珠维E乳膏的质量。

1 仪器和试药

1.1 仪器 LC-10ADVP高效液相色谱仪,包括

LC-10AT泵 、SPD-10A 紫外检测器 、CLASS vp色谱工作站和SCL-10Avp系统控制器(日本岛津制作所);FA-2004电子天平(万分之一,上海天平仪器厂);CPS-3超声波粉碎机(上海声谱有限公司)。

1.2 药品和试剂 维生素E对照品(药用,含量99.8%,浙江天新药业有限公司,批号1003221),维生素B6对照品(药用,含量99.9%,浙江医药股份有限公司新昌制药厂,批号100503);珍珠维 E乳膏(本院药学部制剂室提供,批号 110325、110411和110415);甲醇(色谱纯,美国 Tedia公司,批号1011900);无水乙醇和磷酸均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液制备[1-3]取本品适量(约相当于维生素B6和维生素E含量均为1.0 mg)精密称定,置于烧杯中,加90%乙醇溶液80 ml,采用超声破碎10 min,转移至100 ml量瓶,洗涤烧杯,合并洗涤液至量瓶,50℃水浴加热5 min,冷却后加90%乙醇溶液至刻度,摇匀,过滤后备用。

2.1.2 模拟样品和阴性对照溶液制备 按处方工艺制备不含维生素B6、维生素E的阴性对照样品,以及维生素B6、维生素E含量分别为标示量80%、100%、120%的模拟样品,测定溶液的配制同2.1.1项下方法。

2.1.3 对照品溶液配制 精密称取维生素B6对照品及维生素E对照品各50 mg,分别置50 ml量瓶中,前者加水,后者加甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,制得维生素B6对照品及维生素E对照品储备液。分别精密量取维生素B6、维生素E对照品储备液适量,加80%甲醇溶液稀释至刻度,制得混合对照品溶液;维生素 E和维生素 B6浓度范围均为 1.0、5.0 、10.0 、20.0 、50.0 μ g/ml。

2.2 色谱条件和系统适用性实验[4]色谱柱:Kromasil-C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μ m)。流动相:甲醇(A液)-0.2%磷酸溶液(B液),梯度洗脱,0～4.5 min,A ∶B=86∶14;4.5～18 min,A ∶B=100∶0;18～25 min,A ∶B=86∶14。检测波长 285 nm;流速 1.0 ml/min;进样量 20 μ l;柱温为室温。维生素B6、维生素E与相邻峰的分离度都＞1.5,阴性对照不干扰样品测定。阴性样品、对照品和样品的色谱图见图1。

图1 珍珠维E乳膏的RP-HPLC谱图Figure 1 RP-HPLCphotograms of Pearl vitamin E cream

2.3 标准曲线绘制 精密吸取2.1.3项下混合对照品溶液各20 μ l,进样,测定峰面积。以对照品溶液浓度(c,μ g/ml)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,求得维生素B6和维生素E的线性回归方程。维生素B6的线性回归方程为 A=38467 c+2472.2(r=0.999 9,n=5),维生素E的线性回归方程为A=5 217.3 c-1 624.8(r=0.999 8,n=5),表明各成分在所选定浓度范围内线性关系良好。

2.4 回收率实验 分别取模拟样品溶液各20 μ l,进样,记录峰面积,代入线性回归方程,计算含量并求算回收率。维生素B6的平均回收率为(95.32±0.27)%(n=9),维生素E的平均回收率为(96.91±0.85)%(n=9),表明实验方法的回收率满足测定要求。

2.5 精密度实验 (1)分别取低、中、高(5.0、10.0、20.0 μ g/ml)3 组浓度的混合对照品溶液各 20 μ l,在2.2项色谱条件下,重复进样3次,日内精密度每次进样间隔时间为4 h,日间精密度每次进样间隔时间为24 h。记录峰面积,计算峰面积变异系数。维生素B6低、中、高3个浓度峰面积的日内RSD分别为0.11%、0.23%和0.41%(n=3),维生素E峰面积的日内RSD分别为0.60%、0.94%和0.32%(n=3)。维生素B63个浓度峰面积的日间RSD分别为1.18%、0.79%和0.43%(n=3),维生素E峰面积的日间RSD分别为1.34%、1.34%和0.87%(n=3),表明实验方法的日内、日间精密度满足测定要求。

2.6 重复性实验 取珍珠维E乳膏(批号110411)的供试品溶液6份,进样,测定峰面积并计算含量,维生素B6和维生素E的 RSD分别为0.68%和0.74%(n=6)。

2.7 稳定性实验 在供试品溶液配制后的8 h内,每隔2 h测定一次。维生素B6和维生素E的RSD分别为0.70%和0.74%(n=5),表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 样品测定 分别取3批样品的供试品溶液各20 μ l,进样,记录峰面积,代入线性回归方程,计算含量,并求算两组分相当于标示量的百分比,结果见表1。3批样品中维生素B6和维生素E的平均含量分别为标示量的(94.91±0.77)%和(96.87±0.85)%,均在标示量的90.0%～110.0%,符合外用制剂的含量测定要求。

3 讨 论

维生素B6为水溶性维生素,不易在C18柱中保留,出峰早,而维生素E为脂溶性维生素,易在C18柱中保留,出峰晚。在HPLC法中,采用梯度洗脱方式,可减少维生素E在C18柱中的保留。另外研究发现,采用甲醇-水(75∶25或80∶20)作为流动相时维生素B6峰分别裂解为2个峰和3个峰,同时拖尾情况严重,当在流相中加入0.2%磷酸溶液,峰形对称性获得改善。维生素B6在甲醇-0.2%磷酸溶液(80∶20)条件下保留时间为3.6 min,甲醇的比例增加或减少,维生素B6的保留时间均有延长的趋势;为使维生素B6与杂质峰完全分离且峰形较好,在梯度洗脱的起始阶段使用甲醇-0.2%磷酸溶液(86∶14)为色谱条件。

表1 珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E的含量测定结果Table 1 Contents of vitamin B6and vitamin E in Pearl vitamin E cream

表1 珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E的含量测定结果Table 1 Contents of vitamin B6and vitamin E in Pearl vitamin E cream

批号标示量(1%)的百分含量维生素 B6 维生素E 110325 95.21±0.76 97.22±0.85 110411 95.44±0.72 97.45±0.93 110415 94.08±0.87 95.53±0.56

样品提取方法研究过程中,为得到良好的破乳效果和符合测定要求的提取率,先后采用2%吐温80溶液和1%磷酸溶液,以及80%甲醇氯化钠饱和溶液提取样品。结果表明,2%吐温80溶液对维生素B6检测有干扰,1%磷酸溶液易造成基线不稳,使用80%甲醇氯化钠饱和溶液提取样品反而降低维生素B6的提取率,以上3种溶液均不适宜做为样品测定的提取溶液。最后采用先超声破碎,后水浴加热的提取方法,获得相对理想的回收率。

维生素B6和维生素E的最大吸收波长分别为291 nm[5]和285 nm,但在本研究流动相条件下相同浓度的维生素B6的吸收度值较维生素E要高,故选择285 nm作为同时测定的波长。

经方法学研究表明,本研究所建立的RP-HPLC法准确性和重复性好,可用于同时测定珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E的含量。

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