华中农业大学生命科学与技术学院 方 乐 葛向阳*

浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所 汤江武 姚晓红 吴逸飞 孙 宏

传统营养理论认为，蛋白质必须被消化成游离氨基酸之后才可被消化道吸收利用，蛋白质营养即是氨基酸营养。而新的研究表明，蛋白质经消化道酶降解成游离氨基酸和各种小肽后，小肽以完整的形式和游离氨基酸同时被动物直接吸收利用（陈培赛和薛成君，2008；Backwell，1997b）。小肽是指由多个氨基酸残基组成的具有多种生物功能的肽（崔艳红，2009）。小肽在动物机体内的作用主要有传递神经息、促进胃肠道消化功能、强化养分与吸收、调控物质代谢、参与机体的免疫调节等（Boze，2000；Backwell，1997a）。豆粕是一种优质的饲用蛋白原料，具有较高的蛋白质含量，其氨基酸组成也较平衡，是一种潜在的优质小肽资源（Adetayo，2005）。传统的豆粕发酵主要是利用微生物的作用降低豆粕中的抗营养因子，或利用蛋白酶水解豆粕制备大豆肽，而采用微生物发酵和酶解协同作用处理豆粕，更有效地提高豆粕小肽化程度的报道较少（Lee，2005）。

本研究采用芽孢杆菌、酵母菌和中性蛋白酶混合处理豆粕，并优化菌酶协同处理豆粕工艺，以期获得小肽化程度更高的饲用肽，进而提高豆粕的利用率与蛋白质品质。

1 材料与方法

1.1 材料 豆粕：浙江绍兴中大生物科技有限公司提供，去皮豆粕，粗蛋白质 ≥45%。

菌种：BSW-2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），YT为酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），均为本实验室保藏菌株。

中性蛋白酶：购于上海楷洋生物科技有限公司，酶活 ≥ 50U/g；酶活定义：在（40±0.2）℃，pH 7.0条件下，1 min内水解酪蛋白底物，产生相当于1 μg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）所需的酶量，定义为1个酶活单位，以U/g表示（DB33/T 459-2003）。

1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g、蔗糖（或葡萄糖）20 g、水 1000 mL、pH 值自然；

LB培养基：蛋白栋10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、水 1000 mL、pH 7.0。

1.3 方法

1.3.1 液体种子的制备 枯草芽孢杆菌经斜面活化后刮取一环接入20 mL液体LB培养基，在30℃，160 r/min条件下摇瓶培养12 h，制成种子液；酵母菌经斜面活化后刮取一环接入20 mL液体PDA培养基，在30℃，160 r/min条件下摇瓶培养18 h，制成种子液。

1.3.2 豆粕发酵方法 豆粕基础菌酶协同处理条件为装料量100 g/瓶、中性蛋白酶添加量400 U/g、BSW-2和YT接种量各1%、料水比1∶1、发酵温度30℃、发酵时间48 h基础上，豆粕以一定比例加水，接种，加酶，混合均匀后装入罐头瓶中，用8层纱布加报纸封口，放入培养箱中，设定温度，在实验选取的时间取出，50℃烘干，粉碎，过80目筛待测。

1.3.3 豆粕菌酶混合发酵单因素试验

1.3.3.1 接种量对小肽含量的影响 在基础发酵条件上，控制其他因素不变，分别接种0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的 BSw-2和 YT混合菌液（比例为1∶1）进行发酵，发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

1.3.3.2 加酶量对小肽含量的影响 在基础发酵条件上，控制其他因素不变，分别添加0、100、150、200、250、300、350、400、450、500 U/g 中性 蛋白酶进行发酵，发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

1.3.3.3 料水比对小肽含量的影响 在基础发酵条件上，控制其他因素不变，分别按料水比1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8 加水进行发酵，发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

1.3.3.4 处理温度对小肽含量的影响 在基础发酵条件上，控制其他因素不变，分别设定30、35、40、45、50℃的温度进行发酵，发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

1.3.3.5 处理时间对小肽含量的影响 在基础发酵条件上，控制其他因素不变，分别设定0、12、24、36、48、60、72 h 的时间进行发酵，发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

1.3.4 菌酶协同处理工艺优化 根据单因素试验结果，设计5因素4水平L16（45）的正交试验进行发酵工艺优化。发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽、粗蛋白质含量和进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）。

1.3.5 发酵样品小肽含量的测定 将待测样品过80目筛，等体积加入10%三氯乙酸（TCA），在160 r/min摇床中30 min，然后4000 r/min离心15 min，取上清液做适当稀释后用改良Lowry法测定蛋白质总量（张康，2001；GB/T 22492-2008）。

1.3.6 发酵样品粗蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法，参照GB/T 14771食品中蛋白质的测定方法（GB/T 14771）。

1.3.7 发酵样品蛋白质降解度的检测 发酵样品蛋白质降解度的检测采用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳法，（SDS-PAGE），具体方法见参考文献（高丽和张声华，2009；欧阳亮，2008）。

2 结果与分析

2.1 豆粕菌酶混合发酵工艺的研究

2.1.1 接种量对小肽含量的影响 由图1结果可知：小肽含量随着接种量的增加，说明BSW-2+YT发酵可以使小肽含量得到提高。当接种量为2.5%时，豆粕发酵后小肽含量最高，为185.16 mg/g。

图1 不同接种量对小肽含量的影响

2.1.2 加酶量对小肽含量的影响 由图2结果可知，随着加酶量的增加，小肽含量也呈增加趋势，当加酶量为400 U/g时，小肽含量最高，为192.89 mg/g。

图2 不同加酶量对小肽含量的影响

2.1.3 料水比对小肽含量的影响 料水比是影响固体发酵的重要因素之一。水分含量影响发酵过程中微生物的生长，同时对酶的作用影响也比较大。由图3的结果可知，小肽的含量随着料水比的增加，呈现先增大后减小的趋势，当料水比为1∶1.2时，小肽含量最高，为194.90 mg/g。当料水比过大时，小肽含量呈现减少的趋势，可能是由于芽孢杆菌这类好氧菌在水分过多时生长受到抑制，从而影响了蛋白质降解成小肽。

图3 不同料水比对小肽含量的影响

2.1.4 发酵温度对小肽含量的影响 温度是影响酶活的重要因素，酶活的高低，直接影响到豆粕中蛋白质酶解成小肽。由图4的结果可知，小肽含量随温度的升高，先增加后减少。当发酵温度为40℃时，小肽含量最高，为192.73 mg/g。

图4 不同发酵温度对小肽含量的影响

2.1.5 发酵时间对小肽含量的影响 由图5的结果可知：随着发酵时间的延长，小肽的含量先上升后略有下降。当发酵时间为48 h时，小肽含量最高为182.43 mg/g。当发酵时间长于48 h，随着酶解时间的延长，小肽被进一步酶解生成游离氨基酸，含量反而出现下降趋势，因此酶解时间不宜过长。

图5 不同发酵时间对小肽含量的影响

2.2 豆粕菌酶混合发酵工艺优化 在单因素试验的基础上，得到各因素的适宜水平后，设计5因素4水平L16（45）的正交试验进行发酵工艺优化，试验因素水平编码表、试验设计及实施方案和结果见表1、表 2。

2.2.1 正交试验结果的直观分析 从表2直观分析可以看出，极差列中接种量因素的极差值最大，所以得出结论接种量因素对小肽含量的影响最大，其次是发酵温度、料水比、发酵时间、发加酶量。

发酵最优条件为A1B3C2D4E3，即接种量1.5%，加酶量 450 U/g，料水比 1∶1.4，温度 40 ℃，时间60 h。

2.2.2 发酵方案的确定 从正交表中观察得知最优组合为A1B3C3D3E3，与理论最优条件A1B3C2D4E3对比可知发酵时间不同，结合单因素试验结果，发酵时间过长小肽含量反而有所下降，因此对这两种方案进行3次验证试验，测得小肽含量与粗蛋白质含量见表3。

表1 试验因素编码表

表2 试验设计及实施方案和结果

由表3可知，理论最优条件没有正交表中最优组合结果好，因此最优条件为A1B3C3D3E3，即接种量 1.5%，加酶量 450 U/g，料水比 1∶1.4，温度40℃，时间48 h，发酵结束后小肽含量从11.40 mg/g提高到199.65 mg/g；粗蛋白质从47.62%提高到56.72%。

表3 正交试验验正试验结果

2.3 SDS-PAGE电泳检测蛋白降解程度 将最终确定的发酵工艺的发酵产品进行SDS-PAGE检测，以原料豆粕做对照，结果见图6。

图6结果显示，与原豆粕相比，发酵产品中的大分子蛋白得到有效降解，生成小分子的多肽、小肽和氨基酸，其蛋白质的分子质量在45 kDa以下，小于14.4 kDa的占很大一部份，由此可见，发酵后豆粕的品质得到了有效提升。

图6 发酵豆粕SDS-PAGE图

3 讨论

小肽的制备主要采用微生物发酵法和酶解法。从本质上讲，微生物发酵法和酶解法都是利用蛋白酶的酶解作用（Jung，2006；李书国，2000）。微生物发酵法生产小肽的工艺主要有固体发酵和液体发酵。微生物固体发酵的优点是能较好地去除豆粕中的抗营养因子，发酵过程中加入的微生物如乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等，其本身就是益生菌，有利于改善动物胃肠道的微生态环境，减少抗生素的应用和疾病的发生（吴胜华和李吕木，2008；周伏忠，2007）。本研究采用的是芽孢杆菌和酵母菌混合发酵豆粕，芽孢杆菌相对于霉菌来讲，生长速度较快，发酵周期较短，降低了生产成本。并且在发酵过程中分泌蛋白酶，利用蛋白酶的内切作用将蛋白质降解成低分子质量的肽，因此对豆粕蛋白有较好的降解作用；酵母菌在发酵过程中产生酒香味，使发酵产品的风味有所提升，同时酵母本身也是很好的菌体蛋白，使豆粕发酵后的粗蛋白质提高。

目前酶解法制备小肽，主要采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶（刘通讯，2002）。万琦（2003），刘大川和钟方旭（1996）研究了 5 种蛋白酶：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的特性，筛选出碱性蛋白酶水解大豆蛋白制大豆肽，水解效果虽然较好，但是产物带有强烈的苦味，需要采取一定的脱苦工艺后方可使用。王之盛和况应谷（2004）的研究结果表明，在碱性条件下有利于豆粕抗原蛋白的降解，中碱性条件有利于7S和2S小分子质量抗原蛋白的进一步降解。本研究采用中性蛋白酶酶解豆粕，相对于碱性蛋白酶和酸性蛋白酶，避免固体发酵pH调节困难的问题，使发酵方式更为简单有效。

菌酶混合协同处理法生产小肽，充分利用微生物发酵与酶解各自的优势，发挥微生物与蛋白酶的协同作用使豆粕蛋白降解更充分，小肽化程度更高，同时避免了酶解产品的苦味，提高产品风味及适口性，进一步改善了豆粕饲用肽产品品质和营养价值，这对实现饲用肽的工业化生产具有重要的参考价值。

4 结论

以豆粕为原料，利用芽孢杆菌、酵母菌、中性蛋白酶混合发酵豆粕生产小肽饲料，在接种量1.5%、加酶量 450 U/g、料水比 1∶1.4、发酵温度40℃、发酵时间48 h条件下，豆粕发酵后，小肽含量和粗蛋白含质量都有显著提高，小肽含量从11.40 mg/g提高到 199.65 mg/g；粗蛋白质从47.62提高到56.72%。

[1]陈培赛，薛成俊.小肽的动物营养研究进展[J].养殖与饲料，2008，4：95～97.

[2]崔艳红，韩庆功等.小肽营养的研究及应用 [J].兽药与饲料添加剂，2009，2：20 ～22.

[3]高丽，张声华.大豆蛋白凝胶前后SDS-PAGE图谱比较分析[J].粮油食品科技，2009，17（3）：25 ～27.

[4]李书国，陈辉，杜进民.大豆多肽的功能特性及加工工艺[J].粮油食品科技，2000，27（19）：4 ～5.

[5] 刘大川，钟方旭.酶水解法制备大豆肽的研究[J].中国油脂，1997，22（3）：14～16.

[6]刘通讯，朱小乔，杨晓泉.多酶协同作用生产大豆多肽的研究[J].食品科学，2002，23（11）：29 ～32.

[7]欧阳亮，李亮，蔡源锋.垂直型SDS-PAGE分析发酵豆粕中蛋白类抗营养因子的研究[J].饲料工业，2008，29：43 ～45.

[8]万琦，陆兆新，高宏.脱苦大豆多肽产生菌的筛选及其水解条件的优化[J].食品科学，2003，24（2）：29 ～32.

[9]吴胜华，李吕木.多菌种固态发酵豆粕生产小肽饲料[J].食品与发酵工业，2008，34（10）：113 ～115.

[10]张康.生物制品蛋白质含量Lowry测定法应注意的几个问题[J].海峡药学，2001，4：26.

[11]浙江省质量技术监督局.DB33T 459-2003[S].饲料添加剂：饲料用复合酶制剂.2003.

[12]中华人民工和国国家质量监督检验检疫总.GB/T 14771[S].食品中蛋白质的测定方法：2008.

[13]中华人民工和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 22492-2008[S].大豆肽粉：2008.

[14]周伏忠，贾蕴丽，陈国参.豆粕发酵适宜菌株筛选及其发酵技术研究[J].河南科学，2007，25（3）：409 ～412.

[15]王之盛，况应谷.酶解去除大豆产品抗原蛋白的效果研究[J].饲料博览，2004，11：1 ～4.

[15]Adetayo O，Omoni.Soybean Foods and Their Benefits：Potential Mechanisms of Action[J].Nutrition Reviews，2005，63：272 ～283.

[16]Backwell F R C.Peptide utilization by tissues∶current status and applications of stable isotope procedures[J].Proc Nutr Soc，1997a，53（3）：457 ～464.

[17]Backwell F R C.Quantification of cireulating peptides assessment of peptide uptake across the gastrointestinal tract of sheep[J].Anim Sci，1997，79（3）：315～322.

[18]Boze J J.Portein hydrolysate vs free amino acid based on the nutritional recovery of the starved rat[J].European Journal of Nutrition，2000，39（6）：237～243.

[19]Jung S.Functionality of soy protein produced by enzyme assisted extraction[J].JAOCS，2006，83（1）：71 ～78.

[20]Lee K A.New peptides isolated from a soy protein hydrolysate that inhibit platelet aggregation[J].Food Chemistry，2005，90：389 ～393.