喻 卓，陈 鹏，段 理，何 波，沈志强*

(1昆明医学院第一附属医院，昆明650032;2昆明医学院)

血小板活化后可结合中性粒细胞，并激活所结合的中性粒细胞，中性粒细胞活化后分泌的某些细胞因子，进一步活化血小板［1，2］。因此，血小板—中性粒细胞的相互作用，在血栓形成及炎症过程中起着重要作用，阻抑血小板—中性粒细胞之间相互作用的药物将更有利于血栓栓塞性疾病的防治。松胞菌素D来源于肉球菌，我们在进行抗血小板药物筛选时发现其具有较强地抑制血小板聚集作用。2009年3月～2010年8月，我们在此基础上探讨了松胞菌素D在体内外的抗血小板作用，并进一步观察其对血小板与中性粒细胞之间相互作用的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康家兔，体质量1.8～2.2 kg，雌雄均用，由昆明医学院动物中心提供。

1.2 试剂与仪器 松胞菌素D由中科院昆明植物研究所刘吉开研究员提供，用前溶于0.9%生理盐水中(pH约7.0)。花生四烯酸(AA)、血小板活化因子(PAF)系Sigma公司产品，AA临用前溶于100 mmol/L Na2CO3溶液中，PAF用含0.25%小牛血清蛋白(BAS)的Tris-NaCl缓冲溶液稀释。腺苷二磷酸(ADP)系由Fluka化学公司提供，用前溶于生理盐水中。淋巴分离液(比重1.077)购自上海华精生物高科技有限公司。Hanks液(mmol/L，pH 7.4):NaCl 137，KCl 5，CaCl21.3，MgSO40.7，H2O 0.8，Na2HPO40.6，KH2PO40.4，NaHCO33.0，葡萄糖5.6，用前新配。LBY-NJ血液凝集仪，由北京普利生精密仪器研究中心(北京普利生科贸集团)提供;台式冷冻离心机(centra-MP4R)，由INTERNATIONAL EQUIPMENT COMPANY提供;THZ-C恒温振荡器，由江苏太仓市实验设备厂提供;Olympus像差显微镜属日本生产。

1.3 方法

1.3.1 富血小板血浆(PRP)与洗涤血小板的制备自清醒家兔颈总动脉取血，以3.8%枸橼酸钠(做聚集试验)或2.7%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(做黏附试验)抗凝收集于塑料离心管中，血与抗凝剂体积比为9∶1，室温900 r/min离心8min得PRP，剩余血液继以3 000 r/min离心10min得贫血小板血浆(PPP)，上述PRP以3 000 r/min离心10min得血小板团块，用含1%BSA及1.4%EDTA的磷酸缓冲液(PBS)洗涤血小板3次，最后悬浮于上述PBS液中，调血小板数至1×108cell/ml左右，用台盼兰排斥试验证实其成活率＞95%。

1.3.2 中性粒细胞的制备 吸出PRP后，在上述剩余的抗凝血中加入与PRP等体积的生理盐水，再加入1/6体积的右旋糖酐混匀，于37℃静置30min以沉淀红细胞，将上层白细胞吸出后平铺于3ml淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心30min，弃上清，加入1ml双蒸水溶血30 s，使混杂的红细胞破膜，再加入2倍浓度的PBS 1ml混匀，使中性粒细胞恢复等渗状态，以800 r/min离心10min，中性粒细胞团块用PBS洗3次，最后悬浮于Hanks液中，并分别记数为0.1×107～1.0×107cell/ml，用台盼兰排斥试验证实其成活率＞95%。此悬液再以5 000 r/min离心1min得正常非激活中性粒细胞的上清液，深低温保存备用。

1.3.3 体外血小板聚集性试验 按Born比浊法［3］进行血小板聚集性的测定，即PRP分别与不同浓度的松胞菌素D药液37℃恒温孵育10min再加入诱导剂(终浓度:AA 0.35 mmol/L，ADP 3 μmol/L，PAF 7.2 nmol/L)诱导血小板聚集，并记录5min内最大聚集率，血小板聚集抑制率按下式计算:抑制率(%)=［(1-给药组聚集率/对照组聚集率)］×100。

1.3.4 体内血小板聚集性试验 10mg/kg松胞菌素D以5ml/kg的体积灌胃给药，于给药前和给药后30、60、90、120、180 和240min 各取血1 次，血小板聚集性测定同体外试验。

1.3.5 玫瑰花结试验 改良Hamburger［4］方法，即取50 μl血小板与凝血酶(终浓度为0.2 U/ml)37℃温育15min，然后加入0.9%生理盐水(空白对照)或药液各50 μl，继续静置15min，再加入中性粒细胞悬液50 μl，于4℃振荡30min，取出少许细胞悬液，在常规记数板上于40倍镜下随机记数100个中性粒细胞，其周围黏附有2个或2个以上血小板者为玫瑰花结试验阳性，每个样本记数3次，取其均值，并计算玫瑰花结形成百分率。

1.3.6 松胞菌素D对激活的中性粒细胞引起血小板聚集功能的影响 将250 μl血小板悬液与50 μl中性粒细胞悬液混合成300 μl的细胞悬液，搅拌下于37℃共同温育5min，将药液加入上述细胞悬液中作用5min，然后加入PAF(1 μmol/L)，并按Born比浊法记录5min内最大聚集率。

2 结果

2.1 体外血小板聚集功能 对照组的血小板聚集率为(64.0 ±3.0)%，松胞菌素 D(5、10、25、50、100、200 μmol/L)明显降低ADP诱导的血小板聚集率［(62.5±3.6)%、(60.3±2.3)%、(54.2±2.1)%、(42.1±2.8)%、(32.4±5.4)%和(24.1±4.8)%］，其 IC50为108.4 μmol/L，对PAF 或 AA 诱导的血小板聚集无明显抑制作用。

2.2 体内血小板聚集功能 10mg/kg的松胞菌素D灌胃后，于30min时显著抑制ADP诱导的血小板聚集，血小板聚集率为(59.3±2.6)%，且药效随着时间的延长而递增，到120min时药效达最大(36.4±4.1)%，随后药效又开始减弱并持续至240min(53.7±4.4)%。

2.3 血小板—中性粒细胞黏附 松胞菌素D在5～200 μmol/L的浓度即显著降低两细胞间黏附率，随浓度的升高(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)，黏附率进一步下降［(63.0±3.4)%、(59.0±5.6)%、(50.0±4.3)%、(40.6±2.4)%、(26.4±5.1)%、(18.2 ±4.3)%］，其 IC50为60.4 μmol/L。

2.4 激活的中性粒细胞悬液引起洗涤血小板聚集松胞菌素 D(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)明显抑制PAF(1 μmol/L)激活的中性粒细胞悬液引起的家兔洗涤血小板聚集率［(55.3±5.4)%、(46.1±3.8)%、(38.2±6.5)%、(30.5±3.9)%、(23.3±5.6)%、(15.3±2.7)%］，且呈浓度相关性，其 IC50为48.6 μmol/L。

3 讨论

血小板在不同诱聚剂的作用下发生不同程度的活化反应，根据活化反应的强弱，可将诱聚剂分为弱诱聚剂如ADP，强诱聚剂如PAF，及介于二者之间的AA。本试验结果表明，松胞菌素D在体外、体内对PAF、AA诱导的血小板聚集均无明显抑制作用，而选择性地抑制ADP诱导的血小板聚集。由于条件限制，未能进一步探讨松胞菌素D是否通过选择性拮抗ADP受体来发挥抗血小板作用。松胞菌素D的抗血小板作用对血栓栓塞性疾病的防治具有一定的苗头。

中性粒细胞与血小板之间的相互作用积极参与血栓的形成，激活的血小板通过释放的5-羟色胺及血栓素等活性物质来活化中性粒细胞，激活了的中性粒细胞能使P-选择素快速表达并活化正常血小板，促使中性粒细胞与血小板相互黏附［5，6］，血小板与中性粒细胞间的相互作用(黏附和聚集)可介导血栓的形成。中性粒细胞活化后，中性粒细胞—血小板的玫瑰花结明显增多［7］，松胞菌素D能明显减少上述两种细胞间的黏附作用，并与浓度正相关，提示松胞菌素D对血栓性疾病的防治可能会有积极的影响。PAF激活血小板，诱导P-选择素与白细胞的P-选择素糖蛋白配体结合，促进白细胞与血小板之间相互黏附并在血栓部位的募集［8］。松胞菌素D对PAF直接诱导的血小板聚集无明显抑制作用，而能显著抑制ADP诱导的或PAF激活的中性粒细胞所引起的血小板聚集，提示被PAF激活了的中性粒细胞可能释放了ADP，同时也提示松胞菌素D可能通过拮抗ADP来产生部分抑制PAF激活的中性粒细胞引起的血小板聚集作用。

综上所述，抑制中性粒细胞的激活将有利于避免血小板的活化聚集;松胞菌素D既表现出明显的抗血小板作用，还具有阻抑中性粒细胞与血小板之间的相互作用。从血栓形成现代新概念考虑，这比单一的抗血小板作用更有利于血栓性疾病的防治。

［1］Lo SC，Hung CY，Lin DT，et al.Involvement of platelet glycoprotein Ib in platelet microparticle mediated neutrophil activation ［J］.J Biomed Sci，2006，13(6):787-796.

［2］Ruf A，Patscheke H.Platelet-induced neutrophil activation:platelet-expressed fibrinogen induces the oxidative burst in neutrophils by an interaction with CD11C/CD18 ［J］.Br J Haematol，1995，90(4):791-796.

［3］BORN GV.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal［J］.Nature，1962，194(6):927-929.

［4］Hamburger SA，McEver RP.GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets to neutrophils［J］.Blood，1990，75(3)，550-555.

［5］Bazzoni G，Dejana E，Del Maschio A.Platelet-neutrophil interactions.Possible relevance in the pathogenesis of thrombosis and inflammation ［J］.Haematologica，1991，76(5):491-496.

［6］Shen Z，Dong Z，Cheng P，et al.Effects of plumbagin on platelet aggregation and platelet-neutrophil interactions ［J］.Planta Med，2003，69(7):605-609.

［7］沈志强，吴蓝鸥，段理，等.中性粒细胞对洗涤血小板聚集功能的影响［J］.中国病理生理杂志，2002，18(7):156-158.

［8］常亚丽，郭农建.血小板活化因子参与血小板—中性粒细胞活化的研究［J］.医学综述，2007，13(21):1612-1614.